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Apr 25, 2023

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Band Kommunikationsbiologie

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 508 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Das Adeno-assoziierte Virus (AAV) ist ein wirksamer Vektor für die In-vivo-Gentransduktion und es werden lokale therapeutische Anwendungen von AAVs, beispielsweise bei Hautgeschwüren, erwartet. Die Lokalisierung der Genexpression ist wichtig für die Sicherheit und Effizienz genetischer Therapien. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Genexpression durch die Entwicklung von Biomaterialien mit Polyethylenglykol (PEG) als Träger lokalisiert werden könnte. Hier zeigen wir, dass einer der entwickelten PEG-Träger die Genexpression effektiv auf der Ulkusoberfläche lokalisiert und Off-Target-Effekte in der tiefen Hautschicht und der Leber als repräsentatives Organ zur Beurteilung entfernter Off-Target-Effekte mithilfe eines Maus-Hautgeschwürmodells reduziert . Die Auflösungsdynamik führte zur Lokalisierung der AAV-Gentransduktion. Der entworfene PEG-Träger könnte für In-vivo-Gentherapien unter Verwendung von AAVs nützlich sein, insbesondere für die lokalisierte Expression.

Adeno-assoziierte Viren (AAVs) sind leistungsstarke Vektoren für die In-vivo-Gentransduktion. AAVs werden klinisch als Ersatztherapien zur Behandlung von Erkrankungen wie Lipoproteinlipasemangel, spinaler Muskelatrophie, Netzhautdystrophie und Hämophilie eingesetzt1. Kürzlich wurden die möglichen Anwendungen von AAVs auf lokalisierte Morbiditäten ausgeweitet2.

Aufgrund von Verbesserungen in der Herstellung steigen die durchschnittlichen Dosen von AAVs, die in klinischen Studien verwendet werden. Dies ermöglicht die Verwendung höherer Dosen, was zu stärkeren Phänotypen führt; Allerdings landen die meisten AAV-Vektoren in der Leber und können dort und anderswo Toxizität verursachen3. Daher ist die Kontrolle der Spezifität der Genexpression – die Minimierung von Off-Target-Effekten – bei der Entwicklung von Therapien mit AVVs von großer Bedeutung. Bisher wurde die Spezifität durch die Auswahl und Konstruktion des AAV-Kapsidgewebe-/Zelltropismus4, die Verwendung gewebespezifischer Promotoren5,6 und den Verabreichungsweg3 kontrolliert.

Nicht heilende Wunden, wie z. B. Wunden aufgrund von Druckgeschwüren, diabetischen Geschwüren oder peripherer Gefäßinsuffizienz, geben in Gesellschaften mit zunehmend alternden Bevölkerungen Anlass zur Sorge, und es wird erwartet, dass der AAV-basierte In-vivo-Gentransfer eine nützliche Therapiemethode darstellt7,8. Kürzlich haben wir gezeigt, dass die AAV-vermittelte In-vivo-Induktion der Umprogrammierung wundresidenter mesenchymaler Zellen hin zu Epithelzellen eine De-novo-Epithelisierung von der Oberfläche von Geschwüren ermöglicht. Diese Ergebnisse stellten einen ersten Grundsatzbeweis für die zukünftige Entwicklung innovativer Therapien dar9,10.

Auf der Suche nach klinisch anwendbaren Methoden, die die Sicherheit des AAV-vermittelten Gentransfers auf der Oberfläche von Hautgeschwüren verbessern können, untersuchten wir die Entwicklung von Materialien für die kontrollierte Freisetzung von AAVs auf der Oberfläche von Geschwüren11 unter Verwendung von Polyethylenglykol ( PEG) als Träger. PEG, das aufgrund seiner bioinerten Natur häufig in Biomaterialien verwendet wird, fungiert als Träger, indem es ein Arzneimittel oder Virus in Vesikeln und Hydrogelen einkapselt oder immobilisiert12,13. Injizierbare Hydrogelsysteme, die minimalinvasiv an einer gewünschten Stelle verabreicht werden können, haben aufgrund ihrer Fähigkeit, von einer hochviskosen Matrix zu einer Flüssigkeit mit niedriger Viskosität zu wechseln, zunehmende Aufmerksamkeit für die kontrollierte Virusabgabe erhalten14,15. Allerdings kann die Injektion von flüssigen Hydrogelen mit niedriger Viskosität zu einer Diffusion des eingekapselten Virus führen, d. h. zu einer schnellen Freisetzung aus der Injektionsstelle, was möglicherweise die Behandlung lokalisierter Virusinfektionen beeinträchtigt.

Wir stellten die Hypothese auf, dass ein in einem PEG-Träger mit angemessener Abbaubarkeit eingekapseltes AAV an der Oberfläche von Hautgeschwüren lokal freigesetzt würde. Wir haben einen PEG-Träger entwickelt, der aus einem dynamisch vernetzten Polymernetzwerk besteht (im Folgenden als PEG-Schleim bezeichnet), der die Spezifität der Gentransduktion auf die Oberfläche von Geschwüren verbessert und gleichzeitig lokale oder entfernte Off-Target-Effekte reduziert. Die Verwendung von hochviskosem PEG-Schleim demonstriert eine neue Methode zur hochlokalen Gentransduktion.

Wir haben drei Arten von PEG-Matrizen als mögliche Träger für AAVs mit unterschiedlichen Vernetzungen und Porengrößen vorbereitet. Alle PEGs wurden nach ähnlichen Protokollen gebildet; das heißt, gegenseitig vernetzbare tetrafunktionelle PEGs werden aufgelöst und gleiche Volumina gleicher Konzentrationen der PEG-Vorläufer gemischt (Abb. 1a). (1) PEG-Hydrogel16 (Abb. 1b): Ein synthetisches Hydrogel, das als künstliche extrazelluläre Matrix fungiert, wurde durch die Vernetzung von vierarmigem PEG mit Propylamin-Endgruppe (Tetra-PEG-PA) und vierarmigem PEG mit Succinimidylglutarat-Endgruppe gebildet ( Tetra-PEG-GS) über Amidbindungen, und die Esterbindungen in Tetra-PEG-GS ermöglichten die Hydrolysierbarkeit des Hydrogels. (2) PEG-Schwamm17 (Abb. 1c): ein poröses PEG-Hydrogel, bei dem durch Zugabe von Kaliumsulfat zu den Vorläuferlösungen eine phasengetrennte Struktur erreicht wurde. (3) PEG-Schleim18 (Abb. 1d): eine viskoelastische Polymerflüssigkeit, hergestellt durch Mischen von D(+)-Glucono-1,5-lacton-terminiertem tetraarmigem PEG (Tetra-PEG-GDL) und 4-Carboxy-3- Fluorphenylboronsäure-terminiertes vierarmiges PEG (Tetra-PEG-FPBA) zur Bildung reversibler und schwankender Vernetzungen über zyklische Esterbindungen.

a Schematische Darstellung, die den In-situ-Prozess für die AAV-Verabreichung auf die Oberfläche eines Hautgeschwürs unter Verwendung von PEG-Trägern zeigt. Tetra-PEGs, die mit gegenseitig vernetzbaren Gruppen funktionalisiert und mit AAV-haltigem PB gelöst waren, wurden in gleichen Volumina gemischt, was zur Bildung von PEG-Trägern führte, die das AAV einkapselten. Die vorbereiteten PEG-Träger wurden auf die Oberfläche von Hautgeschwüren auf dem Rücken von Mäusen verabreicht, und AAV wurde durch die Auflösung der PEG-Träger verbreitet. b–d Herstellung von PEG-Trägern. PEG-Hydrogel (b), hergestellt mit Tetra-PEG-PA und Tetra-PEG-GS, PEG-Schwamm (c), hergestellt mit den gleichen Vorläufern wie das PEG-Hydrogel, außer dass Kaliumsulfat in PB zugesetzt wurde, um eine phasengetrennte Struktur zu erzeugen. PEG-Schleim (d) wurde aus Tetra-PEG-GDL und Tetra-PEG-FPBA hergestellt, um ein dynamisch vernetztes System zu erhalten. e Fotografien des PEG-Hydrogels, des PEG-Schwamms und des PEG-Schleims, die das viskoelastische Verhalten beim Ergreifen zeigen. Maßstabsbalken repräsentieren 5 mm. f Young-Modul (E) als Funktion der Zeit (t) des PEG-Hydrogels (violette Dreiecke), des PEG-Schwamms (orangefarbene Rauten) und des PEG-Schleims (blaue Quadrate). E(t) wurde durch E bei 0 s normalisiert [E(0)]. g Fotografien und konfokale Laser-Scanning-Mikroskopbilder von PEG-Trägern im präparierten Zustand. Maßstabsbalken repräsentieren 100 µm.

Trotz der Ähnlichkeiten in den Syntheseprotokollen hatten diese PEG-Träger unterschiedliche Eigenschaften und Strukturen. Der Unterschied in den mechanischen Eigenschaften wurde makroskopisch unter Kompression beobachtet: Das PEG-Hydrogel und der Schwamm zeigten eine vollständig elastische Verformung, während der PEG-Schleim im Laufe der Zeit einen allmählichen Verlust der ursprünglichen Form zeigte. In groben Beobachtungen konnte ein in Kugelform zubereiteter PEG-Schleim seine Form beibehalten, wenn er mit einer Pinzette gegriffen wurde, ähnlich wie ein Hydrogel kurz nach dem Greifen. Allerdings tropfte der gegriffene Schleim später als hochviskose Flüssigkeit von der Pinzette und bildete schließlich eine flache Form auf dem Tisch (Abb. 1e). Der Unterschied wurde dann durch Spannungsrelaxationstests quantifiziert, bei denen die Zeitabhängigkeit des Young-Moduls [E(t)] nach dem Auferlegen einer Kompression auf den Träger beobachtet wird. Mit der Zeitentwicklung nahm der E(t)-Wert für den PEG-Schleim drastisch ab, nahm für den PEG-Schwamm aufgrund der Wasserextraktion leicht ab und blieb für das PEG-Hydrogel konstant (Abb. 1f). Messungen der Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleichung (FRAP) (ergänzende Abbildung 1) zeigten, dass die Fluoreszenzintensität des PEG-Schleims wiederhergestellt wurde, was darauf hindeutet, dass die Spannungsrelaxation von den dynamischen kovalenten Bindungen zwischen GDL und FPBA herrührt. Die Fluoreszenzintensität von PEG-Schleim wurde etwa 60 s nach der Photobleichung vollständig wiederhergestellt, während die von PEG-Hydrogel unverändert blieb. Dies bestätigte die Translationsbewegung der konstitutiven Moleküle des PEG-Schleims und die dynamischen Vernetzungen zwischen diesen Molekülen. Mikroskopische Beobachtungen der PEG-Träger, die mit rot fluoreszenzmarkierten PEG-Vorläufern hergestellt wurden (der terminale Teil der PEG-Vorläufer wurde teilweise mit rotem Fluoreszenzfarbstoff modifiziert, wie zuvor beschrieben17), zeigten strukturelle Unterschiede zwischen den Trägern. Im PEG-Schwamm wurde eine Meeresinselstruktur beobachtet, in der im Bild schwarze Hohlräume mit Porengrößen in der Größenordnung von 10 µm verteilt waren. Im PEG-Hydrogel und Schleim wurde keine charakteristische Struktur beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Netzwerkgröße in der Größenordnung von nm lag (Abb. 1g). Die Phasentrennung wurde durch die Zugabe eines anorganischen Salzes induziert, das die Löslichkeit des PEG verringerte, was zu einem undurchsichtigen Hydrogel führte. Während des Gelierungsprozesses verbinden sich die PEG-Vorläufer miteinander und erhöhen so das Molekulargewicht, was die Phasentrennung vorantreibt17. Die Salzkonzentration wurde so gewählt, dass die Phasentrennung während der Gelierung und nicht in den ursprünglichen Vorläuferlösungen induziert wird17.

Um die Unterschiede in den physikalischen Eigenschaften der PEG-Träger im Detail zu untersuchen, haben wir In-vitro-Vergleichsanalysen durchgeführt. Um das Verständnis der Auflösungskinetik zu erleichtern, wurde ein experimentelles Modell entwickelt. Mit roter Fluoreszenz markierte PEG-Träger wurden auf Kultureinsätzen mit einer Porengröße von 8,0 µm hergestellt (dh kleinere Materialien konnten durchgelassen werden) (Abb. 2a). Für die detaillierte Beurteilung von PEG-Schleim haben wir einen PEG-Schleim vorbereitet, der sich im Vergleich zum Standard-PEG-Schleim schneller auflöst (sogenannter PEG-Soft-Schleim). Die Auflösungsrate, berechnet durch Messung der Fluoreszenzintensität der eluierten Proben, die in vorgegebenen Zeitintervallen durch den Einsatz geleitet wurden, wurde für jedes Gerüst schrittweise erhöht, und die Auflösungsraten nach 24 Stunden (Dsample) betrugen Dhydrogel = 19 %, Dsponge = 16 % , Dslime = 86 % und Dsoft-slime = 90 % (Abb. 2b). Darüber hinaus verkapselten wir fluoreszierende Silica-Nanopartikel mit einem Durchmesser von 30 nm als Modellmaterialien mit einem ähnlichen Durchmesser wie AAVs und untersuchten das Freisetzungsprofil der fluoreszierenden Silica-Nanopartikel aus den PEG-Trägern. Das Freisetzungsverhalten der in jedem Träger eingekapselten Partikel zeigte einen ähnlichen Trend wie das Auflösungsverhalten, und die Freisetzungsraten nach 24 Stunden (RProbe) betrugen Rhydrogel = 38 %, Rsponge = 33 %, Rslime = 75 % und Rsoft- Schleim = 92 %, was darauf hinweist, dass die Freisetzung der Nanopartikel durch die Auflösung der Träger bestimmt wurde (Abb. 2b). Eine Auftragung der Auflösungsrate gegenüber der Freisetzungsrate (Abb. 2c) war für die PEG-Schleime linear. Diese starke Korrelation zeigte, dass die Freisetzung der Partikel durch die Auflösung der PEG-Schleime gesteuert wurde. Dieses Ergebnis zeigte, dass es sich bei den PEG-Schlammen um Pseudofeststoffe handelte, bei denen die Diffusion der Partikel stark eingeschränkt war, die Ladungen jedoch aus der flüssigen Form in die Lösung eluiert werden konnten.

a Schematische Darstellung der In-vitro-Auflösungsbewertung. Die Fotos zeigen die obere Ansicht des Einsatzes. Maßstabsbalken repräsentieren 5 mm. b Zeitliche Auswertung der Auflösungs- (offene Symbole) und Freisetzungsrate (geschlossene Symbole) für PEG-Hydrogel (violette Dreiecke), PEG-Schwamm (orangefarbene Rauten), PEG-Schleim (blaue Quadrate) und PEG-Weichschleim (rote Kreise), hergestellt auf a Kultureinsatz auf einer Kulturplatte platziert. c Zusammenhang zwischen Auflösungsrate und Freisetzungsrate.

Bemerkenswerterweise waren die Freisetzungsraten für die PEG-Schleime 7 Stunden lang nahezu konstant; das heißt, es wurde eine ideale Freisetzungskinetik nullter Ordnung erreicht. Dieses Ergebnis war darauf zurückzuführen, dass die Elution, die die Partikelfreisetzung regelt, näherungsweise nullter Ordnung entsprach, da sie nur durch die Membran erfolgte. Im Gegensatz dazu korrelierte die Freisetzung der Partikel aus dem PEG-Hydrogel und -Schwamm nicht mit einem Bereich mit hoher Freisetzungsrate. Dieses Ergebnis war darauf zurückzuführen, dass diese Träger fest waren und die Partikel hauptsächlich durch Diffusion freigesetzt wurden.

Zur Behandlung von Wunden werden Gentransduktionsmethoden bevorzugt, die hochspezifisch auf die Oberfläche von Geschwüren reagieren. Um die Auswirkungen der PEG-Träger auf die Gentransduktion mit einem AAV zur Behandlung von Hautgeschwüren zu untersuchen, wurden isolierte Hautgeschwüre eingesetzt, die den zentralen Teil eines großen Hautgeschwürs simulierten10. Wir entfernten chirurgisch Haut vom Rücken von Mäusen, um ein Geschwür zu erzeugen, und isolierten die resultierende Wunde mithilfe einer Silikonkammer, die an die tiefe Faszie genäht wurde, von der umgebenden Haut 19, 20 (ergänzende Abbildung 2a). Indem wir die Wunde mithilfe der Kammer von der umgebenden Haut isolieren, können wir Phänomene auf der Geschwüroberfläche ohne Beeinträchtigung durch die umgebende Haut untersuchen, wie z. B. Epithelisierung und Wundkontraktion. GFPNLS-AAVDJ [ein für Zellen in Hautgeschwüren optimierter AAV-Typ10, der grün fluoreszierendes Protein (GFP) mit einem Kernlokalisierungssignal (NLS) kodiert] wurde mit den PEG-Trägern gemischt und auf das Geschwür geimpft. Wir haben die Anzahl positiver Zellen anstelle des Perzentils verwendet, da wir der Ansicht waren, dass ersteres besser für histologische Analysen von Hautgeschwürgeweben geeignet wäre, die aus heterogenen Zelltypen mit undefinierten Rändern bestanden. Wir testeten verschiedene Virustiter in PBS (ergänzende Abbildung 2b) und beobachteten die Geschwüroberfläche mit einem Fluoreszenzmikroskop über die Zeit (bis zum 13. Tag) (ergänzende Abbildung 2c) und Geschwüre 72 Stunden nach der Verabreichung von 1010 Genkopien ( GC) des Virus wurden für die quantitative Analyse ausgewählt (Abb. 3a). Beobachtungen der Geschwüroberflächen mit einem fluoreszierenden Stereoskop zeigten, dass GFPNLS-positive Zellen häufiger bei Tieren beobachtet wurden, die mit in PEG-Schleim, PEG-Weichschleim oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) eingekapselten AAVs behandelt wurden, als bei Tieren in PEG-Hydrogel oder PEG-Schwamm (Abb. 3b, c).

a Verabreichung von GFPNLS-AAVDJ (AAV-DJ-Serotyp, 1 × 1010 GC pro Maus), eingekapselt in PEG-Trägern, auf eine rohe Oberfläche, die in einer Silikonkammer mit 1 cm Durchmesser auf dem Rücken der Mäuse erzeugt wurde. b Repräsentative GFP-positive Zellen auf Hautgeschwüren am Rücken von Mäusen 72 Stunden nach der Verabreichung, beobachtet unter einem Stereomikroskop. Balken = 2 mm. c Anzahl der oberflächlich exprimierten GFP-positiven Zellen, 72 Stunden nach der Verabreichung jedes AAV-haltigen Trägers. Das überlagerte Punktdiagramm zeigt die Verteilung der Daten. Im Vergleich zu den anderen PEG-Trägern wurde bei PEG-Schleim oder Soft-Slime eine signifikant höhere Anzahl oberflächlicher GFP-positiver Zellen beobachtet. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen PEG-Schleim oder Soft-Schleim und PBS festgestellt. * < 0,05, ** < 0,01 (n = 3). d Repräsentative Schnitte, die eine AAV-GFPNLS-Infektion 72 Stunden nach der Verabreichung von PEG-Schleim und PBS-Formulierungen zeigen. Viele GFP-positive Zellen wurden in der tiefen Schicht beobachtet, wenn AAV-GFPNLS mit PBS verabreicht wurde, wohingegen die meisten GFP-positiven Zellen in der oberflächlichen Schicht nach Verabreichung von PEG-Schleim gefunden wurden. Die gestrichelten Linien zeigen den Rand zwischen der oberflächlichen und der tiefen Schicht an. Balken = 500 µm. e Anzahl der GFP-positiven Zellen in der oberflächlichen Schicht (oberhalb des Unterhautgewebes) und in der tiefen Schicht (bis zum Muskelgewebe) bei jedem Tier. Das überlagerte Punktdiagramm zeigt die Verteilung der Daten. Beachten Sie, dass der PEG-Schleim eine Infektion des tiefen Gewebes deutlich verhinderte, es jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen den Formulierungen hinsichtlich der Anzahl der GFP-positiven Zellen in der oberflächlichen Schicht gab. * < 0,05 (n = 5).

Während die Einkapselung von PEG-Hydrogel und PEG-Schwämmen die Gentransduktionseffizienz auf der Oberfläche von Hautgeschwüren verringerte, behielt die Einkapselung von PEG-Schleim die ursprüngliche Transduktionseffizienz bei, wie sie bei PBS beobachtet wurde. Die PEG-Schleime wurden für die weitere histologische Untersuchung verwendet, wobei der Schwerpunkt auf der Gentransduktionsspezifität in der oberflächlichen Schicht von Hautgeschwüren lag. Geschwüre, die mit GFPNLS-AAVDJs behandelt wurden, die mit PEG-Schleim, PEG-Weichschleim und PBS formuliert waren, wurden präpariert und histologisch auf die Anzahl GFPNLS-positiver Zellen in den oberflächlichen (Granulations- und Fettgewebe) und tiefen (Faszien und Muskeln) Schichten analysiert (Abb . 3d und ergänzende Abb. 2a). In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der stereoskopischen Beurteilung wurden keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl positiver Zellen in den Oberflächenschichten von Tieren gefunden, die mit PEG-Schleim, PEG-Weichschleim oder PBS behandelt wurden. Im Gegensatz dazu nahm die Anzahl der GFPNLS-positiven Zellen in den tiefen Schichten bei den mit PEG-Schleim behandelten Tieren im Vergleich zu den mit PBS behandelten Mäusen signifikant ab, und der Grad der Reduktion war bei den mit PEG-Schleim behandelten Tieren im Vergleich zu den mit PEG behandelten Tieren größer Mit weichem Schleim behandelte Mäuse (Abb. 3e). Um die möglichen Unterschiede in der Gentransduktionseffizienz im Hinblick auf die Multiplizität der Gentransduktion weiter zu untersuchen, wurden Mischungen aus zwei unterschiedlich fluoreszierenden AAVs (GFPNLS-AAVDJ und mCherryNLS-AAVDJ) auf die Oberfläche des Geschwürs verabreicht und die Häufigkeit duplizierter Gene ermittelt Die Transduktion wurde gemessen (ergänzende Abbildung 3a). Die Anzahl der duplizierten Gentransduktionen stimmte zwischen PBS und PEG-Schleim überein, was weiter darauf hinweist, dass es bei mit PEG-Schleim und PBS behandelten Mäusen keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Multiplizität der Gentransduktion gab (ergänzende Abbildung 3b). Da die Verwendung eines PEG-Schleimträgers die lokale, schichtspezifische Effizienz der Gentransduktion im Vergleich zu den anderen Trägern verbesserte, untersuchten wir weiter die Fernwirkungen dieses Trägers außerhalb des Ziels.

Der AAV-Zelltropismus unterscheidet sich je nach Serotyp, und daher hängt die Bedeutung jedes Organs als entferntes Off-Target vom Serotyp ab. Zuvor haben wir die Verteilung von AAVDJ in verschiedenen Organgeweben nach der Injektion von Luciferase-AAVDJs untersucht und festgestellt, dass die Luciferase-Expression hauptsächlich auf die Leber beschränkt ist10. Um den möglichen Einfluss der PEG-Schleimverkapselung zu untersuchen, wurde die Off-Target-GFPNLS-Expression in der Leber 28 Tage nach der Inokulation der Geschwüre mit dem AAVDJ-Vektor in einem PEG-Schleimträger (PBS) in einer Hautkammer untersucht. Mit einem Stereoskop wurde eine kleine Anzahl GFPNLS-positiver Zellen auf der Leberoberfläche beobachtet (Abb. 4a). Ein quantitativer Vergleich mittels qPCR der AAV-Titer in der Leber zeigte, dass die genomischen Kopien bei Verwendung des PEG-Schleimträgers im Vergleich zu PBS signifikant reduziert wurden (Abb. 4b). Somit hat die Verwendung eines PEG-Schleimträgers das Potenzial, entfernte Off-Target-Effekte zu reduzieren.

Ein in PEG-Schleim eingekapseltes oder mit PBS verdünntes GFPNLS-AAVDJ (AAV-DJ-Serotyp, 5 × 1010 GC pro Maus) wurde auf eine rohe Oberfläche auf dem Rücken von Mäusen verabreicht. Nach 4 Wochen wurde die Leber zur quantitativen Analyse, einschließlich qPCR-Bewertungen, entnommen. Für die statistische Analyse waren nicht genügend GFP-positive Zellen vorhanden. Der ausgefüllte Pfeilkopf zeigt eine GFP-positive Zelle an, die mit einem Stereoskop in der Leber beobachtet wurde. Schwarzer und weißer Balken = 5 mm, roter Balken = 500 µm. b Genomische DNA wurde aus sechs Lappen jeder entnommenen Leber extrahiert, um die AAV-Infektionsraten zu bestimmen. Die AAV-Titer waren in der Schleimgruppe signifikant verringert. (n = 7) * <0,05.

Durch eine Reihe von In-vivo-Experimenten wurde festgestellt, dass PEG-Schleime nützliche Träger für die oberflächenspezifische AAV-Gentransduktion sind, während PEG-Schwamm- und PEG-Hydrogel-Träger die Gentransduktionseffizienz im Vergleich zu PBS verringerten. Wir glauben, dass diese Unterschiede mit den Freisetzungsprofilen der PEG-Schleime zusammenhängen, die in den oben beschriebenen In-vitro-Bewertungen ermittelt wurden. Um die möglichen mechanistischen Eigenschaften des PEG-Schleims aufzuklären, wurden fluoreszierend markierte AAVs 21, 22, 23 verfolgt, und wir stellten fest, dass ein zuverlässiger Nachweis aufgrund der schwachen Fluoreszenzsignale im Vergleich zu den Hintergrundsignalen schwierig war (ergänzende Abbildung 4a – c). Stattdessen wurde das Verhalten von Silica-Nanopartikeln auf der Oberfläche von Hautgeschwüren untersucht. Im ersten Versuch wurden grün fluoreszierende Silica-Nanopartikel (mit einem Durchmesser von 30 nm, ähnlich dem von AAVs24) in PBS beimpft. Die Nanopartikel waren zunächst in der oberflächlichen Schicht lokalisiert und diffundierten dann mit der Zeit in tiefere Schichten wie Fett- und Muskelgewebe. Wichtig ist, dass nach 24 Stunden nur noch wenige Partikel auf der Ulkusoberfläche verblieben sind (ergänzende Abbildung 5). Dementsprechend wurden 24 Stunden als experimenteller Zeitrahmen für die folgende quantitative Analyse des Einflusses des PEG-Trägers auf die Auflösung von PEG und die Freisetzung der Silica-Nanopartikel verwendet.

Grün fluoreszierende Silica-Nanopartikel wurden mit PEG-Trägern oder PBS gemischt und dann auf ein Geschwür geimpft (Abb. 5a). Bei den PEG-Trägern verblieben im Vergleich zu PBS nach 24 Stunden mehr Silica-Nanopartikel auf der Oberflächenschicht. Dieser Effekt war bei PEG-Schleim und PEG-Softschleim größer als bei PEG-Hydrogel und PEG-Schwamm (Abb. 5b, c). Die verlängerte oberflächenspezifische Verteilung von Silica-Nanopartikeln unter Verwendung eines PEG-Schleimträgers könnte mit der oberflächenspezifischen AAV-Gentransduktion verbunden sein.

a Verabreichung von fluoreszierenden Silica-Nanopartikeln, die in PEG-Trägern eingekapselt sind, auf die rohe Oberfläche auf dem Rücken von Mäusen. PEG-Hydrogel und Schwammträger wurden in die Kammer injiziert, während PEG-Schleim eingeführt wurde, da der Schleim nicht injiziert werden konnte. Das Dach der Silikonkammer wurde 24 Stunden nach der Verabreichung zur Beobachtung geöffnet. b Vergleich der Partikeldiffusion von den PEG-Trägern, 24 h nach der Verabreichung. Repräsentative Bilder aus einem Stereoskop und Schnitten. Beachten Sie, dass die mit PEG-Schleim verabreichten Partikel auf der Geschwüroberfläche konzentriert waren, wohingegen die Partikel bei Verabreichung mit PBS in die Muskeln diffundierten. Balken = 1 mm. c Die Anzahl der fluoreszierenden Silica-Nanopartikel in der Oberflächenschicht. Das überlagerte Punktdiagramm zeigt die Verteilung der Daten. Bei PEG-Schleim und Soft-Schleim stieg die Anzahl der fluoreszierenden Nanopartikel in der Oberflächenschicht deutlich an. (n = 3) * <0,05, ** <0,01, *** <0,001.

Mit PEG-Schleim nahm die Anzahl der Silica-Nanopartikel in der Oberflächenschicht zu, obwohl die AAV-vermittelte Gentransduktion in der Oberflächenschicht nicht zunahm. Wir gingen davon aus, dass diese Diskrepanz möglicherweise auf den Zerfall von AAVs in PEG im Laufe der Zeit zurückzuführen ist.

Um die möglichen Auswirkungen der Lagerungszeit bei Körpertemperatur und der Lösungsmittellösung auf die Gentransduktionsfähigkeit von AAVs zu bestimmen, haben wir die Gentransduktionsfähigkeit von AAVs getestet, die 0, 3, 6, 12, 18 und 24 Stunden lang bei 37 °C aufbewahrt wurden oder ohne Mausblutserum in vitro (Abb. 6a). Wenn AAVs in Abwesenheit von Serum 3 bis 18 Stunden lang bei 37 °C gehalten wurden, verringerte sich die Gentransduktionsfähigkeit von AAVs allmählich auf ein Zehntel der ursprünglichen Fähigkeit. Im Gegensatz dazu blieb die Gentransduktionsfähigkeit der AAVs erhalten, wenn AAVs 24 Stunden lang mit Serum aufbewahrt wurden (Abb. 6b). Die gentransduzierende Fähigkeit von AAVs in PEG-Schleim, formuliert mit PEG und PBS, könnte mit der Zeit abnehmen, wohingegen diese Verringerung möglicherweise abgeschwächt wird, sobald AAVs aus PEG-Schleim freigesetzt werden. Im Laufe der Zeit könnte der Zerfall von AAVs in PEG zur Diskrepanz im Verhalten der Silica-Nanopartikel und der Gentransduktionseffizienz in der Oberflächenschicht beitragen.

a Die Gentransduktionseffizienz von GFPNLS-AAVDJ, die 0, 3, 6, 12, 18 und 24 Stunden lang bei 37 °C mit oder ohne Mausblutserum aufbewahrt wurde, wurde in vitro an aus Fettgewebe gewonnenen Stromazellen (mASCs) von Mäusen getestet. b Die Gentransduktionsfähigkeit von GFPNL-AAV nahm nach Lagerung bei 37 °C in Abwesenheit von Serum allmählich ab, während sie nach 24-stündiger Lagerung mit Serum konstant blieb. Das überlagerte Punktdiagramm zeigt die Verteilung der Daten. (n = 4).

In der vorliegenden Studie wurden verschiedene PEG-Träger anhand eines In-vivo-Hautgeschwürmodells untersucht. Der PEG-Schleim lokalisierte erfolgreich die Genexpression auf der Ulkusoberfläche, wobei die Genexpression sowohl in der tiefen Muskelschicht als auch in der Leber im Vergleich zu den anderen untersuchten Trägern deutlich reduziert wurde.

Um die detaillierte Kinetik von AAVs zu untersuchen, wurde Fluoreszenzmarkierung verwendet. Aufgrund der schwachen Fluoreszenzsignale im Vergleich zu den Hintergrundsignalen war eine zuverlässige Rückverfolgung jedoch schwierig. Alternativ verwendeten wir Silica-Nanopartikel, da jedes Partikel eine starke Fluoreszenz aufwies und in Gewebeproben von Hautgeschwüren zuverlässig nachgewiesen werden konnte. Die Möglichkeit, dass AAV- und Silica-Nanopartikel möglicherweise nicht das gleiche Verhalten zeigen, ist eine grundlegende Einschränkung der aktuellen Studie.

Die In-vivo-Gentransduktionseffizienz unterschied sich zwischen den verschiedenen PEG-Trägern. Dieser Unterschied wurde auf die Auflösungsmechanismen zurückgeführt, die sich aus den unterschiedlichen Vernetzungsformen ergeben. In den PEG-Hydrogelen und -Schwämmen waren alle Moleküle durch irreversible Bindungen verbunden. Somit hatten diese Träger Eigenschaften, die für Feststoffe charakteristisch sind; Die In-vitro-Charakterisierung zeigte, dass sie unter konstanter Belastung einen endlichen Elastizitätsmodul aufwiesen (Abb. 1f). In-vitro-Bewertungen der PEG-Auflösungsraten und Partikelfreisetzungsraten zeigten, dass beide Raten bei der Verwendung von Hydrogelen und Schwämmen im Vergleich zu den anderen Trägern deutlich reduziert waren, was darauf hindeutet, dass die Nanopartikel in den Netzwerken eingeschlossen waren (Abb. 2b). .

Im Allgemeinen geht man davon aus, dass feste Polymermaterialien wie PEG-Hydrogele und Schwämme homogen abgebaut werden, was als Massenabbau bezeichnet wird, und nicht allmählich von der Oberfläche abgebaut werden25,26,27. Mit anderen Worten: Die Kettenspaltung erfolgt im Laufe der Zeit homogen durch Hydrolyse. Wenn die Netzwerkkonnektivität schließlich unter ein bestimmtes Niveau fällt, gehen die PEG-Hydrogele und -Schwämme von einem Feststoff in einen flüssigen Zustand über. Daher geht man davon aus, dass PEG-Hydrogele und -Schwämme im Vergleich zu den anderen Trägern eine geringere Partikelfreisetzung aufweisen, da sie beim Abbau in Gewebe mit eingeschlossenen AAV-Partikeln eindringen (Abb. 7a). Experimente mit fluoreszierenden Partikeln zur Bewertung der physikalischen Bewegung von Nanopartikeln zeigten, dass sowohl Hydrogele als auch Schwämme im Vergleich zu PEG-Schleimen zu einer geringeren Anzahl von Partikeln in der oberflächlichen Schicht von Geschwüren führten (Abb. 5b, c).

Ein PEG-Hydrogel oder Schwammträger, die AAVs einkapseln, wurden durch Mischen gelierender Vorläufer von Tetra-PEGs mit Succinimidylglutarat- (Tetra-PEG-GS) und Propylamin- (Tetra-PEG-PA) Gruppen an den Enden hergestellt, die durch Kondensation unter Bildung von Amiden miteinander vernetzt wurden Verknüpfungen, bei denen es sich um irreversible Bindungen handelt. Ursprünglich in Tetra-PEG-GA eingeführte Estergruppen wurden zwischen die PEG-Moleküle eingeführt, die schließlich hydrolysiert werden, um das Hydrogel oder den Schwamm abzubauen. Der Abbauprozess kann in diesen Trägern homogen ablaufen, was als Massenabbau bezeichnet wird, anstatt dass der Abbau allmählich von der Oberfläche aus erfolgt. Beim Abbau der Träger diffundieren eingekapselte AAVs in die oberflächlichen oder tiefen Schichten und infizieren die umliegenden Zellen. b PEG-Schleim wurde durch Mischen wässriger Lösungen von Tetra-PEGs mit Diol- oder Borsäure-Endgruppen (Tetra-PEG-GDL und Tetra-PEG-FPBA) hergestellt, die durch eine zyklische Esterreaktion gegenseitig vernetzt wurden, um reversible Koordinationsbindungen zu bilden Fesseln. Die reversible Vernetzung verleiht der PEG-Matrix eine hochviskoelastische Eigenschaft, wodurch die Matrix flüssig wird. Diese PEG-Flüssigkeit könnte in ihrer Form variiert werden, um ein Hautgeschwür abzudecken und AAVs einzukapseln, ohne durch die Hautschichten zu diffundieren. PEG-Schleim diffundiert von der Grenzfläche zwischen Schleim und Hautgeschwür in die oberflächliche Schicht, anstatt abgebaut zu werden. Da PEG-Schleim in die oberflächliche Schicht eindringen kann, schwillt der PEG-Schleim an und verdünnt sich, was zu einer Infektion der umliegenden Zellen führt, was zu einer Verringerung der Genexpression außerhalb des Ziels in der Leber führt. c Mit PBS verabreichtes AAV diffundierte schnell. Die Gentransduktionsfähigkeit wird nicht beeinträchtigt, bis AAV tiefe Schichten erreicht. Daher infizieren AAV effektiv sowohl oberflächliche als auch tiefe Schichten.

AAV-Partikel erfordern für eine erfolgreiche Infektion durch Endozytose den direkten Kontakt mit Zellen6. Daher wurde eine AAV-Infektion unterdrückt, wenn AAV-Partikel in einem PEG-Netzwerk gefangen waren, da kein direkter Kontakt mit Zellen bestand. Mit anderen Worten: Nicht freigesetzte AAV-Partikel sind nicht infektiös, was nach der AAV-Verabreichung unter Verwendung eines PEG-Hydrogels oder -Schwamms zu einer verminderten GFP-Expression auf der Ulkusoberfläche führte.

Im Gegensatz dazu waren die Moleküle im PEG-Schleim durch reversible Bindungen verbunden, was zu einem Gleichgewicht zwischen Bindung und Dissoziation der Moleküle führte (ergänzende Abbildung 1). Der Elastizitätsmodul des Schleims nahm mit der Zeit ab und erreichte Null (Abb. 1f), was darauf hindeutet, dass der Schleim aus thermodynamischer Sicht eine Flüssigkeit war. Daher könnte der auf die Geschwüroberfläche aufgetragene PEG-Schleim als Flüssigkeit diffundieren und von der Geschwüroberfläche in die tieferen Gewebe eindringen; PEG-Schleim und PBS wurden hinsichtlich der Träger- und AAV-Diffusion als gleichwertig angesehen.

PEG-Schleim zeigte bemerkenswerte Eigenschaften, die sich von PBS unterschieden. Sowohl die Auflösungs- als auch die Freisetzungsraten des Schleims waren niedriger als bei der Verwendung von PBS (Abb. 2b), und die Auflösungs- und Freisetzungsraten im Zeitverlauf waren nahezu identisch (Abb. 2c). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Partikel gleichzeitig mit der lokalen Dissoziation von PEG im Schleim freigesetzt wurden. Die im PEG-Schleim enthaltenen Nanopartikel waren nach der Anwendung auf die Geschwüroberfläche beschränkt (Abb. 5b), wodurch das Eindringen vom Interstitium in die tieferen Gewebe begrenzt wurde, was möglicherweise darauf zurückzuführen ist, dass der Schleim länger auf der Geschwüroberfläche verblieb als PBS. Mit anderen Worten: Im Gegensatz zu den feststoffähnlichen PEG-Hydrogelen und -Schwämmen diffundierten die Partikel im flüssigkeitsähnlichen PEG-Schleim translatorisch27, und die AAV-Infektion trat überwiegend auf der Geschwüroberfläche auf, wo sich der PEG-Schleim befand (Abb. 7b).

Der PEG-Schleim war während der Virusinfektion stärker lokalisiert als der weiche PEG-Schleim, der eine geringere Viskoelastizität aufwies, was zu einer überwiegend reduzierten tiefen Infektion mit PEG-Schleim führte (Abb. 3e). Da die lokalen Off-Target-Infektionen in der tiefen Schicht begrenzt waren, war auch die Off-Target-Expression in der Leber verringert.

In früheren Berichten hat die Gentherapie mit viralen Vektoren unter Verwendung von Trägern zu einer unterdrückten Freisetzungsrate viraler Vektoren aus den Trägern geführt. Beispielsweise führte ein Lentivirus mit einem Hydrogel und Analoga zu einer Verlängerung der lokalen Aktivität in vitro27 und in vivo28; ein mit Fibrin übertragenes Adenovirus hatte eine erhöhte Bioaktivität und eine verlängerte Halbwertszeit in situ29; und ein AAV mit Gelatine wies eine erhöhte lokale Konzentration der bioaktiven Substanz auf30.

Das Verhalten von Silica-Nanopartikeln auf der Oberfläche von Hautgeschwüren mit oder ohne PEG-Träger deutete auf den potenziellen Nutzen von PEG-Trägern bei der Abgabe anderer Arten von Medikamenten und Biomolekülen hin. Die Aufklärung anderer Verhaltensweisen, wie z. B. Dosisabhängigkeit sowie zeitabhängige Diffusion, Bioverteilung und Clearance subkutan verabreichter Substanzen, sollte in zukünftigen Studien durchgeführt werden.

PEG-Schleim könnte die absolute Menge der in der oberflächlichen Schicht verabreichten AAV-Partikel erhöhen, obwohl dieser Anstieg durch den Zerfall von AAVs innerhalb von PEG im Laufe der Zeit zunichte gemacht wurde, wodurch die Anzahl positiver Zellen in tieferen Schichten sowie die Gesamtzahl positiver Zellen verringert wurden . Infolgedessen verbesserte der in der vorliegenden Studie entwickelte Tetra-PEG-Träger die lokale Aktivität nicht signifikant. Die Gentransduktion war in der oberflächlichen Hautschicht lokalisiert und es kam zu einer deutlichen Abschwächung von Off-Target-Effekten.

Wir haben eine neue Technologie zur Erzeugung expandierbarer Epithelgewebe durch die direkte Neuprogrammierung wundresidenter mesenchymaler Zellen beschrieben, die es allen Regionen der Wunde ermöglicht, sich ohne die räumlichen Einschränkungen, die während der normalen Heilung beobachtet werden, erneut zu epithelisieren9,10. Die Transduktion von Reprogrammierungsfaktoren induziert möglicherweise eine direkte Reprogrammierung von Nicht-Epithelzellen in Epithelzellen und damit die Bildung von ektopischem Epithelgewebe an anderen Stellen als der oberflächlichen Schicht von Hautgeschwüren. Darüber hinaus ist es wünschenswert, potenzielle Nebenwirkungen zu minimieren, die das Transgen in entfernten Organen hervorrufen kann.

In unserer ersten Proof-of-Concept-Studie wurden bei der begrenzten Anzahl kleiner Tiere keine Nebenwirkungen festgestellt. Dennoch sollten alle möglichen Maßnahmen für die weitere Entwicklung hin zur klinischen Anwendung ergriffen werden. Wir glauben, dass die aktuellen Erkenntnisse nicht nur für die Entwicklung der Gentherapie gegen Hautgeschwüre von Nutzen sein könnten, sondern auch für alle Arten von therapeutischen Entwicklungen, die lokal begrenzt sind und daher äußerst starke Auswirkungen erwarten.

Die anderen Einschränkungen der aktuellen Studie liegen in den Unterschieden zwischen den Hautstrukturen von Menschen und Mäusen31. Zu den Hauptunterschieden zählen die Dicke der geschichteten Bestandteile wie der Dermis und des subkutanen Fettgewebes, das Fehlen von Schweißdrüsen bei Mäusen und das Vorhandensein der dünnen Muskelschicht, die als Panniculus carnosus in der Rückenhaut von Mäusen bekannt ist. Diese Unterschiede haben möglicherweise keinen wesentlichen Einfluss auf die Ergebnisse der aktuellen Studie, da die Experimente mit dem Hautgeschwür in einer Silikonkammer durchgeführt wurden. Dennoch ist bei klinischen Anwendungen eine sorgfältige Interpretation der Ergebnisse erforderlich. Die andere Einschränkung liegt im experimentellen Modell. Die Verabreichung flüssiger AAVs in einer geschlossenen Kammer unterscheidet sich grundlegend von der tatsächlichen Verabreichung im klinischen Umfeld, bei der die Lösung direkt auf die offene Wundoberfläche aufgetragen wird. Die Verwendung viskoelastischer Flüssigkeiten als Träger von AAVs könnte für die Reduzierung der AAV-Abgabe von Vorteil sein32, obwohl dies experimentell nicht bestimmt werden konnte.

Die Verwendung von PEG-Schleim, einer hochviskoelastischen Flüssigkeit, als Träger für AAVs führte zu einer lokalisierten Genexpression in der oberflächlichen Schicht des Hautgeschwürs und reduzierte die Off-Target-Effekte im Vergleich zu anderen Trägern und einer PBS-Kontrolle. Die in der vorliegenden Studie entwickelte kontrollierte Freisetzung mithilfe des PEG-Trägers ebnet den Weg für zukünftige lokalisierte Gentherapien.

Das Tetra-PEG-PA und Tetra-PEG-GS (Mw = 20 kg mol−1) (NOF Corporation, Japan) wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Mit primärem Amin (Mw = 20 kg mol−1) (Tetra-PEG-NH2) (SINOPEG, China) funktionalisiertes Polyethylenglykol wurde ohne weitere Reinigung verwendet. Kaliumsulfat (K2SO4), superdehydriertes Methanol, superdehydriertes Dimethylsulfoxid, GDL, FPBA, Triethylamin (TEA), 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4- Methylmorpholiniumchlorid-n-hydrat (DMT-MM) und 4 % Paraformaldehydphosphatpufferlösung (PFA) (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Japan) wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Alexa FluorTM 594 NHS-Ester (Succinimidylester) (Alexa-NHS) und Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) (Thermo Fisher Scientific, USA) wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Phosphatpuffer (pH 7,4; PB) wurde in einer Konzentration von 200 mM hergestellt. RC15-AC (Sartorius, Deutschland), ARVO™ alle Experimente. Als Wasser wurde während der gesamten Studie Milli-Q-Wasser verwendet.

Tetra-PEG-GDL und Tetra-PEG-FPBA wurden gemäß einem früheren Bericht durch Kopplung der relevanten Moleküle an Tetra-PEG-NH2 synthetisiert18. Für Tetra-PEG-GDL, Tetra-PEG-NH2 (1000 mg, 0,05 mmol), GDL (89 mg, 0,5 mmol, 10 Äquivalente Tetra-PEG-NH2) und TEA (50 mg, 0,5 mmol, 10 Äquivalente). . Tetra-PEG-NH2) wurden in 30 ml superdehydratisiertem Methanol gelöst. Die Mischung wurde gerührt und 3 Tage lang bei 35 °C inkubiert. Die gemischte Lösung wurde dann jeweils 24 Stunden lang mit einer Spectra/Por®-Dialysemembran (MWCO: 6000–8000 Da, Spectrum Laboratories, Griechenland) gegen überschüssiges Methanol und Wasser dialysiert. Die Lösung wurde mit einem 0,45-μm-Filter filtriert und gefriergetrocknet, um Tetra-PEG-GDL zu erhalten (Ausbeute: 900 mg). Das erhaltene Polymer wurde durch 1H-NMR (Bruker Avance DPX-400 MHz, USA) unter Verwendung von D2O als Lösungsmittel charakterisiert.

Für die Synthese von Tetra-PEG-FPBA, Tetra-PEG-NH2 (1000 mg, 0,05 mmol), FPBA (91 mg, 0,5 mmol, 10 Äquivalente Tetra-PEG-NH2) und DMT-MM (138 mg, 0,5 mmol, 10 Äquivalente Tetra-PEG-NH2) wurden in 30 ml superdehydratisiertem Methanol gelöst. Die Mischung wurde gerührt und 3 Tage lang bei 35 °C inkubiert. Die gemischte Lösung wurde dann mit einem Überschuss an 10 mM wässriger HCl, 10 mM wässrigem NaOH, Phosphatpuffer (pH 7,4, 10 mM), 100 mM wässrigem NaCl und destilliertem Wasser jeweils 24 Stunden lang unter Verwendung einer Dialysemembran dialysiert. Die Lösung wurde mit einem 0,45-μm-Filter filtriert und gefriergetrocknet, um Tetra-PEG-GDL zu erhalten (Ausbeute: 900 mg). Das erhaltene Polymer wurde durch 1H-NMR unter Verwendung von D2O als Lösungsmittel charakterisiert.

PEG-Hydrogel, PEG-Schwamm und PEG-Schleim wurden durch Auflösen gegenseitig vernetzbarer Tetra-PEGs und Mischen der gleichen Volumina der Tetra-PEGs hergestellt. Diese PEG-Träger wurden mit den folgenden Vorläufern vernetzt. (1) PEG-Hydrogel: Tetra-PEG-PA und Tetra-PEG-GS wurden getrennt in PB gelöst, um eine Konzentration von PEG (CPEG) = 60 g l−1 zu ergeben. (2) PEG-Schwamm: Tetra-PEG-PA und Tetra-PEG-GS wurden getrennt in PB mit 250 mM K2SO4 gelöst, um CPEG = 60 g l−1 zu erhalten. (3) PEG-Schleim: Tetra-PEG-GDL und Tetra-PEG-FPBA wurden getrennt in PB gelöst, um CPEG = 60 g l−1 zu erhalten.

Mit roter Fluoreszenz markiertes Tetra-PEG-PA und Tetra-PEG-GDL wurden hergestellt, um die innere Struktur der PEG-Gerüste sichtbar zu machen. Für Tetra-PEG-PA wurden 1000 mg Tetra-PEG-PA in 20 ml destilliertem Wasser gelöst und 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Separat wurde 1 mg Alexa-NHS in 1 ml superdehydratisiertem Dimethylsulfoxid gelöst und 16 µl (0,01 Äquivalente Tetra-PEG-PA) zur Tetra-PEG-PA-Lösung gegeben. Die gemischte Lösung wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend 3 Stunden lang gegen überschüssiges destilliertes Wasser dialysiert, um nicht reagierte Moleküle zu entfernen, und gefriergetrocknet, um teilweise mit roter Fluoreszenz markiertes Tetra-PEG-PA als hellrotes Pulver zu erhalten ( Ausbeute: 950 mg). Das mit roter Fluoreszenz markierte Tetra-PEG-PA und Tetra-PEG-GS wurden in PB mit Konzentrationen von K2SO4 = 0 und 300 mM gelöst, um CPEG = 60 g l−1 zu erhalten. Diese beiden Vorläufer wurden im gleichen Volumen gemischt, in eine zylindrische Silikonform (Durchmesser: 5 mm und Höhe: 1 mm) gegossen und 24 Stunden bei 25 °C inkubiert. Die erhaltenen Proben wurden mit einem CLSM beobachtet.

Für die Synthese von Tetra-PEG-GDL wurden vor der Reaktion von GDL mit Tetra-PEG-NH2 1000 mg Tetra-PEG-NH2 in 20 ml superdehydratisiertem Methanol gelöst. Anschließend wurden der Lösung 16 Mikroliter (0,01 Äquivalent Tetra-PEG-NH2) Alexa-NHS zugesetzt und die Lösung 24 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden GDL und TEA gemäß der für die Herstellung von Tetra-PEG-GDL beschriebenen Methode zu der gemischten Lösung hinzugefügt. Mit roter Fluoreszenz markiertes Tetra-PEG-GDL und Tetra-PEG-FPBA wurden dann in PB gelöst, um CPEG = 60 g l−1 zu erhalten. Diese beiden Vorläufer wurden im gleichen Volumen gemischt, in eine zylindrische Silikonform gegossen und 24 Stunden lang bei 25 °C inkubiert, gefolgt von der Beobachtung mit einem CLSM.

Mit roter Fluoreszenz markierte PEG-Vorläufer für PEG-Hydrogel und PEG-Schleim wurden in eine zylindrische Silikonform (Durchmesser: 5 mm und Höhe: 1 mm) gegossen und 24 Stunden lang bei 25 °C inkubiert. Unter CLSM wurden inkubierte PEG-Träger 1 s lang mit einem Kreis von 20 µm gebleicht und die Wiederherstellung der Fluoreszenzintensität beobachtet.

Ein In-vivo-Modellsystem unter Verwendung eines Hautgeschwürs auf der Oberfläche von Mäuserücken wurde mit einem Zellkultureinsatz mit 12 Vertiefungen (Porengröße 8,0 µm) (Becton, Dickinson and Company, USA) entworfen, der auf einem 12-Well-Zellkultureinsatz platziert wurde -Well-Kulturplatte und die Auflösungskinetik bzw. das Freisetzungsverhalten wurde mit diesem System ausgewertet. Für die Auflösungskinetik wurden 100 µl eines PEG-Gerüsts, das teilweise mit roter Fluoreszenz am Ende des PEG-Moleküls markiert war, auf dem Insert vorbereitet und 24 Stunden bei 25 °C inkubiert. Anschließend wurden 1000 bzw. 2500 µl DPBS in den Einsatz bzw. die Wellplatte gegeben. Bei Raumtemperatur und im Dunkeln wurde eine 2500-µl-Probe aus der Wellplatte entnommen, um die Konzentration der durchdrungenen Substanzen zu jedem Zeitpunkt zu bewerten. Nach der Probenahme der Lösung wurde ein ähnliches Volumen an frischem DPBS in die Wellplatte gegeben, um das Volumen aufrechtzuerhalten. Die Konzentration der durchdrungenen Proben wurde durch Messung der Fluoreszenzintensität (λex = 580 nm, λem = 590 nm) mit einem Mikroplattenlesegerät bestimmt. Die Auflösungsrate wurde als Prozentsatz im Vergleich zur Gesamtmenge an mit roter Fluoreszenz markiertem Tetra-PEG bewertet.

Um das Freisetzungsverhalten eines Modellvirus zu untersuchen, wurde in jeder Vorläuferlösung von Tetra-PEG-GDL eine Lösung von Silica-Nanopartikeln (1 mg ml−1, sicastar®-green F, Durchmesser 30 nm, Micromod Partikeltechnologies, Deutschland) suspendiert für PEG-Schleim und Tetra-PEG-PA für PEG-Hydrogel oder -Schwamm bei einer Konzentration von 0,1 mg ml−1 und CPEG = 60 g l−1. Die gemischte Lösung wurde zu den PEG-Vorläufern gegeben, um PEG-Träger herzustellen, die Nanopartikel enthalten. Das Freisetzungsverhalten der Nanopartikel wurde nach der für die Auflösung von PEG-Trägern beschriebenen Methode bewertet, mit Ausnahme der Messung der Fluoreszenzintensität (λex = 460 nm, λem = 480 nm).

Der Spannungsrelaxationstest für PEG-Schwamm wurde mit dem Kompressionsgerät Rheogel-E4000 (UBM, Japan) für die zylindrischen Proben (Durchmesser: 15 mm, Höhe: 7 mm) bei 25 °C durchgeführt. Nach dem Aufbringen einer kleinen Dehnung (ε = 0,5) wurde der Spannungsabfall als Funktion der Zeit beobachtet. Die Relaxation des Elastizitätsmoduls [E(t)] wurde als Spannung dividiert durch die angelegte Dehnung berechnet. Für PEG-Hydrogel und PEG-Schleim wurden die dynamischen viskoelastischen Messungen mit einem spannungsgesteuerten Rheometer (MCR301; Anton Paar, Graz, Österreich) mit einer parallelen Plattenhalterung mit einem Durchmesser von 25 mm durchgeführt. Die Winkelfrequenzabhängigkeit (0,1–100 rad s−1) der Speicher- (G′) und Verlustmodule (G′′) wurde bei 25 °C gemessen. Die Amplituden der oszillierenden Scherdehnung wurden für alle Tests im Bereich der linearen Viskoelastizität bestätigt. Wir haben die G′- und G′′-Daten unter der Annahme der isovolumetrischen Verformung (E = 3G) in E(t) umgewandelt.

Um die AAVs zu erzeugen, wurden Plasmide von AAVDJ, pAAV-GFPNLS, pAAV-mCherryNLS, pAAV-DNP63A und pAD5 hergestellt und unter Verwendung der Cäsiumchloridmethode10 auf kultiviertes subkonfluentes 293AAV transfiziert. Das GFPNLS- und mCherryNLS-Plasmid enthielt die Nuclear Localization Signals (NLSs)-Sequenz und die posttranskriptionelle regulatorische Elementsequenz der Waldmurmeltier-Hepatitis. Die Anzahl der Genkopien wurde mittels qPCR quantifiziert. Die verwendeten Primersequenzen waren wie folgt: AAV-ITR (Fw: GGAACCCCTAGTAGTGATGGAGTT; Rv: CGGCCTCAGTGAGCGA).

Das AAV-Virus wurde in PBS verdünnt, um 5 × 1010 Genkopien (GC) in 5 µl zu erzeugen. Ungefähr 5 µl der vorbereiteten AAV-Lösung wurden in 45 µl Tetra-PEG-GDL für PEG-Schleim und Tetra-PEG-PA für PEG-Hydrogel oder -Schwamm auf CPEG = 60 g l−1 gemischt, und die gemischte Lösung wurde zu 50 µl hinzugefügt 60 g l−1 PEG-Vorläufer zur Herstellung von PEG-Trägern, die AAV enthalten, um CPEG = 60 g l−1 zu erhalten. Da PEG-Schleim unmittelbar nach dem Mischen aushärtet, wurde der Schleim zu Partikelkörnchen mit einer Grundfläche von 1 × 1 cm und einer Größe geformt, die der Geschwürbasis entsprach. Als Kontrolle wurden 5 μl PBS mit 5 × 1010 GC AAV-Virus in 95 μl PBS gemischt.

Vier Wochen alte weibliche C57BL/6-Mäuse wurden von Nippon Bio-Supp (Japan) gekauft. Alle Tierversuche wurden vom Tierforschungsausschuss der Universität Tokio genehmigt. Die aus Silizium gefertigten Kammern wurden mit einem 3D-Drucker20 synthetisiert. Kurz gesagt wurde mit einem 3D-Drucker eine Form einer kappenförmigen Silikonkammer mit einem 5 mm breiten Flansch hergestellt und durch Mischen zweier Flüssigkeiten Silikon in die Kammer gegossen. Die synthetisierte Siliziumkammer wurde im Autoklaven sterilisiert.

Die Befestigungsmethode basierte auf der Methode, die wir zuvor für einen Haarrekonstruktionstest zur Untersuchung von Hautgeschwüren beschrieben haben20. Der Bereich zwischen den Schulterblättern wurde wegen der hohen Stabilität der Kammerfixierung und der Wirksamkeit bei der Aufrechterhaltung der Ulkusoberfläche über einen längeren Zeitraum als Befestigungsstelle für die Kammer ausgewählt. Unter Vollnarkose mit Isofluran wurde die Kammerbefestigungsstelle gründlich rasiert. Unter dem Panniculus carnosus wurden kreisförmige Bereiche (Durchmesser 1 cm) der Haut und des Unterhautgewebes chirurgisch entfernt. Die Kammer wurde eingesetzt und der Rand sowie die darüber liegende Haut wurden an vier Stellen mit 5-0 Ethilon® (Johnson and Johnson, USA) vernäht.

PEG-Hydrogel- und PEG-Schwammformulierungen wurden durch direktes Auftropfen der flüssigen Komponente auf die Oberfläche des Hautgeschwürs verabreicht, bevor die Flüssigkeit aushärtete, und zwar durch einen kleinen Einschnitt nahe der Oberseite der Silikonkammer. Nach der Verabreichung der Mischung wurde die Inhalationsnarkose in Bauchlage 5 Minuten lang fortgesetzt und die Inhalation des Anästhetikums nach Bestätigung der Heilung an der Ulkusoberfläche beendet. PBS mit AAV, der Kontrollgruppe, wurde ebenfalls auf die gleiche Weise verabreicht, indem die Flüssigkeit direkt auf die Oberfläche des Hautgeschwürs in der Kammer getropft wurde. PEG-Schleim wurde anders verabreicht als die anderen Materialien, da er hart genug war, um direkt mit einer Pinzette gefasst zu werden. Die Silikonkammer wurde zu 3/4 geöffnet und der Schleim direkt auf die Geschwüroberfläche aufgetragen. Nach der Verabreichung wurde die Mitte der Kammeröffnung mit einem einzigen Stich aus 5-0-Nylon vernäht, um einen dichten Verschluss aufrechtzuerhalten und ein Austrocknen der Geschwüroberfläche zu verhindern.

Mäuse wurden durch eine Luxation des Halswirbels nach Inhalationsanästhesie eingeschläfert, die Kammer wurde geöffnet und die Rückseite der Kammer wurde unmittelbar nach der Verarbeitung mit einem Stereomikroskop (Axio Zoom®, Carl Zeiss, USA) beobachtet. Anschließend wurde Hautgewebe, einschließlich der Silikonkammer, vorsichtig bis knapp über die Brustwand, einschließlich der mittleren Muskelschicht des Rückens, entnommen, über Nacht in 4 % PFA fixiert und über Nacht in 30 % Saccharose gelegt. Proben, die die fixierte Ulkusoberfläche enthielten, wurden in eine Verbindung mit optimaler Schneidtemperatur (OCT Compound®, Sakura Finetek, JAPAN) eingebettet und gefrorene Proben wurden vorbereitet. Die Schnitte wurden mit einem Kryostat als 12-µm-Scheiben hergestellt, zweimal mit PBS gewaschen, in 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Eindeckmedium (Fluoromount-G® mit DAPI, Thermo Fisher Scientific, USA) fixiert und auf Fluoreszenz beobachtet. Die Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbung wurde mit der allgemeinen Technik durchgeführt10.

Aus den Bildern, die mit einem Stereomikroskop im Axiozoom Z-Stack-Modus aufgenommen wurden, wurde die Schicht mit der am deutlichsten erkennbaren Grenze infizierter Zellen verwendet. Für jede Probe wurden fünf Bereiche (20 µm im Quadrat) mit Fokus zufällig ausgewählt. Die Anzahl der Zellen im Rahmen wurde visuell gezählt und der Mittelwert berechnet. Die ungefähre Anzahl wurde anhand der Fläche der Ulkusoberfläche berechnet. Für jede Probe wurden drei Schnitte entnommen, die an drei im Allgemeinen gleichmäßig verteilten Orten entnommen wurden. Unter Verwendung der Ergebnisse der HE-Färbung benachbarter Abschnitte wurde die Anzahl der fluoreszierenden Partikel oder positiven Zellen visuell unter einem Sichtfeld mit 40-facher Vergrößerung gezählt, aufgeteilt in Ober- und Unterschichten des Fettgewebes und der Muskelschichten.

Um die AAV-Titer auf Off-Target-Effekte in der Leber zu analysieren, wurden Proben aus sechs Lappen entnommen und genomische DNA mit einem kommerziellen Kit (DNeasy® Blood & Sample Kit, QIAGEN, Deutschland) extrahiert. Die Kopienzahlen des AAV-Genoms wurden an 100 ng genomischer DNA mittels qPCR auf einem StepOne Plus-Echtzeit-PCR-System (Thermo Fisher Scientific, USA) gemessen. Die Primer verwendeten die virale Genomsequenz speziell für AAV-ITR (Fw: GGAACCCCTAGTAGTGATGGAGTT; Rv: CGGCCTCAGTGAGCGA) und das Maus-Titin-Gen (Fw: CTCCATCACTAGGGGTTCCT; Rv: TTCAGTCATGCTGCTAGCGC). Die Kopienzahl der AAV-Genome wurde als absoluter Wert pro diploidem Kern ausgedrückt. Alle genomischen DNA-Proben wurden dreifach analysiert.

DNP63A-AAVDJ (1 × 1012 GC) wurde mit einem im Handel erhältlichen Proteinmarkierungskit (Alexa Fluor® 568 Protein Labeling Kit, Thermo Fisher Scientific, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers markiert3.

Subkutane Leisten- und Gesäßfettpolster wurden von eingeschläferten 3–5 Wochen alten Mäusen entnommen. Fettgewebe wurde enzymatisch verdaut10 und die stromale Gefäßfraktion wurde durch Zentrifugation isoliert, auf eine mit Gelatine beschichtete Platte mit 6 Vertiefungen geimpft, wobei für jede Mausprobe eine Vertiefung verwendet wurde, und in vollständigem DMEM-Wachstumsmedium bestehend aus DMEM (enthaltend 4,5 g l-1 Glucose) gehalten , 110 mg l-1 Natriumpyruvat und 4 mM L-Glutamin), ergänzt mit 10 % (v/v) hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 1:100 (v/v) MEM-Lösung nicht-essentieller Aminosäuren (Gibco) und 1:100 (v/v) GlutaMAX-Ergänzungsmittel (Gibco).

P3-Primär-mASCs wurden auf einen Objektträger auf einer Zellkulturplatte getropft, mit 5 × 104 Zellen in 200 μl komplettem DMEM-Wachstumsmedium. Nach einer Stunde Inkubation bei 37 °C wurde das Medium bis zur regulären Zellkultivierungsdosis auf die Platte gegeben. Nach 24-stündiger Inkubation wurden MOI 2000 (GC pro Zelle) markierter AAVs auf die Platte gegeben. Nach einer Stunde Inkubation bei 4 °C wurden die am Deckglas befestigten Zellen gründlich gesammelt und dann mit DAPI-Färbung versehen, um sie unter einem konfokalen Mikroskop zu beurteilen.

Markiertes AAV (1 × 1010 GC pro Maus) und Silica-Nanopartikel (Enddosis; 20-fache Verdünnung) wurden in 100 μl PBS gemischt und dem Mäusegeschwür in der Kammer verabreicht. Die Geschwüre wurden 24 Stunden später zur histologischen Beobachtung gesammelt.

P3-primäre mASCs wurden auf einer Platte mit 24 Vertiefungen (Grundfläche 1,9 cm2) mit 1 × 104 Zellen in jeder Vertiefung ausgesät. Nach 24-stündiger Inkubation wurde den Zellen GFPNLS-AAVDJ verabreicht. GFPNLS-AAVDJ wurde bei 37 °C mit oder ohne Mäuseblutserum (gereinigt mit BD Microtainer® Serumröhrchen mit Trenngel) für einen bestimmten Zeitraum (0–24 Stunden) inkubiert und dann an mASCs verabreicht. Das Kulturmedium wurde 24 Stunden nach der AAV-Verabreichung erneuert. GFP-positive Zellen wurden 72 Stunden nach der Infektion in vierfachen Vertiefungen gezählt.

Zur Bewertung der statistischen Signifikanz wurde Excel-Software (Microsoft, USA) verwendet. Um die Signifikanz zwischen zwei Gruppen zu bestimmen, wurden ungepaarte zweiseitige Student-t-Tests angewendet. p ≤ 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Es wurde davon ausgegangen, dass die Datenverteilung normal ist. Es wurden keine statistischen Methoden verwendet, um die Stichprobengröße vorab zu bestimmen, aber unsere Stichprobengrößen ähnelten denen, die in einer früheren Veröffentlichung angegeben wurden10. Die Datenerfassung und -analyse erfolgte nicht blind.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Quelldaten für die Grafiken und Diagramme in den Abbildungen sind als ergänzende Daten verfügbar und alle weiteren Informationen können auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor eingeholt werden. Materialien sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

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Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI Grant Nummern JP20H03847 (an MK) unterstützt; JSPS KAKENHI-Stipendium für anspruchsvolle Forschung (Pionierarbeit) (JP20K20609) (an MK); JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (A) (JP21H04688) (an TS); Zuschuss für transformative Forschungsbereiche (JP20H05733) (an TS); Zuschüsse für JSPS-Stipendiaten (21J10828) (an MK); Zuschüsse für JSPS-Stipendiaten (JP20J01344) (an SI); Zuschüsse für Nachwuchswissenschaftler (JP20K15338) (an TK); Japan Science and Technology Agency (JST) CREST unter der Fördernummer JPMJCR1992 (an TS); und AMED unter der Fördernummer JP21zf0127002 (an MO, TS und MK). Victoria Muir, PhD, von Edanz (https://jp.edanz.com/ac) hat einen Entwurf dieses Manuskripts bearbeitet.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Motoi Kato, Shohei Ishikawa.

Abteilung für Plastische und Rekonstruktive Chirurgie, Graduate School of Medicine, Universität Tokio, 7-3-1, Hongo, Bunkyo-ku, Tokio, Japan

Motoi Kato, Qi Shen, Zening Du, Takao Numahata, Mutsumi Okazaki und Masakazu Kurita

Abteilung für Bioingenieurwesen, School of Engineering, Universität Tokio, 7-3-1, Hongo, Bunkyo-ku, Tokio, Japan

Shohei Ishikawa, Takuya Katashima und Takamasa Sakai

Zentrum für Krankheitsbiologie und Integrative Medizin, Graduate School of Medicine, Universität Tokio, 7-3-1, Hongo, Bunkyo-ku, Tokio, Japan

Mitsuru Naito

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TS und M. Kurita haben die Studie entworfen. M. Kato und SI haben die Experimente entworfen. Die Datenerfassung und/oder -analyse wurde von M. Kato, SI, TK und TN durchgeführt. AAVs wurden von QS, ZD, TN und M. Kurita erstellt. Polymere wurden von TK und MNM Kato, SI, TK, TS und M. synthetisiert. Kurita verfasste das Manuskript. Administrative, technische oder aufsichtsrechtliche Aufgaben wurden von MO, TS und M. Kurita übernommen.

Korrespondenz mit Takamasa Sakai oder Masakazu Kurita.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Dan Wang, Navneet Matharu und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Huan Bao, Eve Rogers und Anam Akhtar. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Kato, M., Ishikawa, S., Shen, Q. et al. In situ formbarer, dynamisch vernetzter Poly(ethylenglykol)-Träger für lokalisierte Adeno-assoziierte Virusinfektionen und reduzierte Off-Target-Effekte. Commun Biol 6, 508 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04851-w

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Eingegangen: 14. Juni 2022

Angenommen: 19. April 2023

Veröffentlicht: 16. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04851-w

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