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May 29, 2023

Omega

Band Nature Communications

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 3013 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Pulmonale Hypertonie ist eine seltene tödliche Erkrankung, die durch einen erhöhten pulmonalen arteriellen Widerstand eine Rechtsherzinsuffizienz verursacht. Es besteht ein ungedeckter medizinischer Bedarf an der Entwicklung von Therapeutika, die sich auf den Umbau der Lungengefäße konzentrieren. Bioaktive Lipide, die von perivaskulären Entzündungszellen produziert werden, könnten den Gefäßumbau modulieren. Hier zeigen wir, dass von ω-3-Fettsäuren abgeleitete Epoxide (ω-3-Epoxide), die von PAF-AH2, einer oxidierten Phospholipid-selektiven Phospholipase A2, aus Mastzellen freigesetzt werden, die pulmonale Hypertonie negativ regulieren. Die genetische Deletion von Pafah2 bei Mäusen beschleunigt den Gefäßumbau, was zu einer Verschlimmerung der hypoxischen pulmonalen Hypertonie führt. Die Behandlung mit ω-3-Epoxiden unterdrückt die Aktivierung von Lungenfibroblasten durch Hemmung der TGF-β-Signalübertragung. In vivo bremst die Ergänzung mit ω-3-Epoxiden das Fortschreiten der pulmonalen Hypertonie in mehreren Tiermodellen ab. Darüber hinaus identifiziert die Sequenzierung des gesamten Exoms für Patienten mit pulmonaler arterieller Hypertonie zwei mögliche pathogene Varianten von Pafah2. Unsere Ergebnisse belegen, dass die PAF-AH2-ω-3-Epoxidproduktionsachse ein vielversprechendes therapeutisches Ziel für pulmonale Hypertonie sein könnte.

Pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) ist eine seltene, tödliche Erkrankung, die eine idiopathische Pulmonalarterienstenose verursacht, die zu einem erhöhten Pulmonalarteriendruck führt und diese chronische Drucküberlastung schließlich zu Rechtsherzversagen und zum Tod führt. Pulmonale Hypertonie (PH) ist durch irreversible Gewebeveränderungen gekennzeichnet, die als „pulmonaler Gefäßumbau“ bekannt sind und an denen Endothelzellen der Lungenarterie, glatte Muskelzellen und Fibroblasten beteiligt sind1,2. Obwohl die verfügbaren PH-Therapien das Überleben von Patienten mit PAH3 deutlich verbessert haben, erreicht ein erheblicher Teil der Patienten nicht die erwartete Wirksamkeit. Daher gelten Medikamente, die den Umbau der Lungengefäße unterdrücken und das Fortschreiten der Krankheit verlangsamen können, als ungedeckter medizinischer Bedarf, der möglicherweise die Überlebensrate der Patienten erhöhen kann4.

Entzündungszellen spielen eine wichtige Rolle beim Gewebeumbau. Beim Lungengefäßumbau produzieren verschiedene Arten von Entzündungszellen im Lungengewebe humorale Faktoren wie Zytokine und Chemokine, die die Veränderungen des Gefäßgewebes steuern1,2,5. Darüber hinaus werden Lipidmediatoren auch von lokalen Entzündungszellen produziert und diese Mediatoren regulieren Entzündungen, Thrombusbildung, Angiogenese und Fibrose, was allesamt den Gefäßumbau beschleunigen kann6,7. Tatsächlich wurde gezeigt, dass proinflammatorische funktionelle Lipide wie Prostanoide und Leukotriene zur Pathogenese von PH8,9,10 beitragen. Andererseits ist bekannt, dass ω-3-Fettsäuren, vor allem Eicosapentaensäure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA), eine bioprotektive Rolle spielen, und einige ihrer Derivate sollen einzigartige Funktionen besitzen, die den Gewebeumbau unterdrücken können6 ,11,12,13. Mithilfe eines durch Drucküberlastung induzierten Herzumbaumodells zeigte unser vorheriger Bericht, dass von Makrophagen freigesetzte EPA-Metaboliten die abnormale Aktivierung von Herzfibroblasten unterdrückten und die Gewebehomöostase aufrechterhielten14. Daher wird erwartet, dass ω-3-Fettsäuren und ihre Derivate auch den Umbau der Lungengefäße bei PH unterdrücken, dies muss jedoch noch ermittelt werden.

Hier haben wir durch eine umfassende Lipidomanalyse von PH-Lungenproben und eine phänotypische Analyse von Knock-out (KO)-Mäusen den Typ II-Plättchenaktivierungsfaktor Acetylhydrolase (PAF-AH2), ein ω-3-Epoxid produzierendes Enzym aus Membranphospholipiden, entdeckt dass epoxidierte ω-3-Fettsäuren einen 3-gliedrigen Ringether (ω-3-Epoxide; 17,18-EpETE und 19,20-EpDPE) als funktionelle Lipidmediatoren aufweisen, die an der Pathogenese von PH beteiligt sind. Omega-3-Epoxide wurden ständig aus Mastzellen in der Lunge produziert, um eine abnormale Aktivierung von Adventitia-Fibroblasten zu unterdrücken, und sie zeigten therapeutische Wirkungen auf PH, selbst wenn sie äußerlich verabreicht wurden. Wir fanden auch pathogene Mutationen von PAF-AH2 bei PAH-Patienten, die nicht ausreichend auf aktuelle Therapeutika ansprachen, was darauf hindeutet, dass ω-3-Epoxid ein wertvolles therapeutisches Ziel für PAH sein könnte.

Um wertvolle funktionelle Lipide zu identifizieren, die in PH-Lungen charakteristisch verändert waren, führten wir eine umfassende Lipidomanalyse mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) durch, um die Metaboliten EPA, DHA und Arachidonsäure (AA) im Lungengewebe zu bestimmen Mäuse mit PH, hervorgerufen durch chronische Hypoxie (10 % Sauerstoffkonzentration). Wir fanden heraus, dass die Konzentrationen der ω-3-Epoxide 17,18-EpETE und 19,20-EpDPE und ihrer inaktiven Dihydrodiole 17,18-diHETE und 19,20-diHDoPE in Geweben hypoxischer Lungen verringert waren (Abb. 1a–c, ergänzende Abb. 1a–e). Entsprechend diesen Ergebnissen war die Expression von PAF-AH2, einem Schlüsselenzym, das zur Familie der Phospholipasen A2 gehört und vorzugsweise ω-3-Epoxid-haltige Membranphospholipide hydrolysiert, um ω-3-Epoxide freizusetzen15, auch in Geweben hypoxischer Lungen signifikant verringert ( Abb. 2a).

a, b Omega-3-Fettsäure-Metaboliten in LC-MS/MS-basierten Lipidomics der Lunge von WT-Mäusen, die 4, 14 und 28 Tage lang Normoxie oder Hypoxie (10 % O2) ausgesetzt waren. a EPA-Metaboliten, b DHA-Metaboliten. Der Z-Score wurde aus dem Durchschnittswert jeder Gruppe (n = 3) berechnet und als Heatmap angezeigt. c Der Gehalt an ω-3-Epoxiden (17,18-EpETE und 19,20-EpDPE) und ihren Dihydrodiolen (17,18-diHETE und 19,20-diHDoPE), bewertet durch LC-MS/MS-basierte Lipidomik der Lunge von WT-Mäuse, die 4, 14 und 28 Tage lang Normoxie oder Hypoxie ausgesetzt waren (n = 3). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. Die P-Werte wurden durch eine einfache ANOVA mit dem Post-Hoc-Test von Dunnett bestimmt.

ein Western-Blot von PAF-AH2 im Gesamtprotein aus der Lunge von WT-Mäusen und Pafah2-KO-Mäusen, die 8 Wochen lang Normoxie oder Hypoxie ausgesetzt waren (links) und Quantifizierung durch Densitometrie (rechts). Die Experimente wurden dreimal wiederholt und die Daten gepoolt. b Der Gehalt an ω-3-Epoxiden, bestimmt durch LC-MS/MS-basierte Lipidomik der Lunge bei WT-Mäusen und Pafah2-KO-Mäusen, die 8 Wochen lang Hypoxie ausgesetzt waren (n = 4,5). c Repräsentatives Bild histologischer Schnitte mit HE-Färbung (oben) und EVG-Färbung (unten) der Lunge von WT-, Pafah2-KO- und Pla2g7-KO-Mäusen, die 8 Wochen lang Normoxie oder Hypoxie ausgesetzt waren. Maßstabsbalken, 50 μm. d–f Die Bewertung des PH-Schweregrades bei WT-, Pafah2-KO- und Pla2g7-KO-Mäusen, die 8 Wochen lang Normoxie oder Hypoxie ausgesetzt waren (Normoxie, n = 4,4,4; Hypoxie, n = 6,8,6). Wandstärke der Lungenarteriolen (d), RVSP (e), Gewichtsverhältnis von RV zu LV + Septum (f). Die Experimente wurden zweimal wiederholt und die Daten gepoolt (e, f). g Relative mRNA-Spiegel von Nppa im RV von Hypoxie-exponierten WT-Mäusen und Pafah2-KO-Mäusen (n = 6, 8). Die Expressionsniveaus wurden auf die der ribosomalen 18S-RNA und dann auf die im RV von WT-Mäusen normalisiert. h Kaplan-Meier-Kurven von Hypoxie-exponierten WT-, Pafah2-KO- und Pla2g7-KO-Mäusen bis zum Alter von 100 Tagen (n = 16). Log-Rank-Test; WT vs. Pafah2 KO, P = 0,002, Pafah2 KO vs. Pla2g7 KO, P = 0,011. Die Experimente wurden dreimal wiederholt und die Daten gepoolt. i Relative mRNA-Spiegel von Col1a1 in der Lunge von WT-Mäusen und Pafah2-KO-Mäusen, die 8 Wochen lang Normoxie oder Hypoxie ausgesetzt waren (n = 6). Die Expressionsniveaus wurden auf die der ribosomalen 18S-RNA und dann auf die in der Lunge von WT-Mäusen normalisiert. j Repräsentatives Bild der Immunhistochemie für Vimentin und CD31 in der Lunge von WT-Mäusen und Pafah2-KO-Mäusen, die 8 Wochen lang Hypoxie ausgesetzt waren. Kerne wurden mit DAPI markiert. Maßstabsbalken, 50 μm. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. Die P-Werte wurden durch eine zweiseitige ANOVA mit dem Post-Hoc-Test von Bonferroni (a), eine einfaktorielle ANOVA mit dem Post-hoc-Test von Tukey (d–f) oder einen zweiseitigen Student-T-Test (b, g, i) bestimmt.

Um die Bedeutung von ω-3-Epoxiden bei der Entwicklung von PH zu bestimmen, untersuchten wir den Phänotyp von Mäusen mit PAF-AH2-Mangel, die einer chronischen Hypoxie ausgesetzt waren (8 Wochen). Pafah2-KO-Mäuse produzierten in ihren Lungen unter hypoxischen Bedingungen geringere Mengen an ω-3-Epoxiden, insbesondere 17,18-EpETE und 19,20-EpDPE, im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen (WT) (Abb. 2b, ergänzende Abb. 2a). ). Die histologische Analyse ergab, dass Pafah2-KO-Mäuse mit PH einen fortgeschrittenen Lungengefäßumbau aufwiesen, wie z. B. eine Verdickung der Lungenarterienwand und schwere perivaskuläre Fibrose (Abb. 2c, d). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen hatten Pafah2-KO-Mäuse während der Herzkatheteruntersuchung einen höheren rechtsventrikulären systolischen Druck (RVSP) als die WT-Mäuse, was auf einen erhöhten Schweregrad der PH hinweist (Abb. 2e). Darüber hinaus zeigten Pafah2-KO-Mäuse mit hypoxischem PH eine fortgeschrittene Rechtsherzinsuffizienz, wie z. B. eine erhöhte rechtsventrikuläre (RV) Hypertrophie (Abb. 2f) und höhere mRNA-Spiegel von Nppa, einem Herzinsuffizienzmarker, im RV (Abb. 2g). in einer hohen Sterblichkeitsrate von fast 80 % innerhalb von 100 Tagen nach hypoxischer Exposition (Abb. 2h). Obwohl wir die Auswirkungen des Geschlechts auf das PH-Mausmodell untersuchten, wurden keine Unterschiede im Schweregrad der hypoxischen PH und im Phänotyp der verschlimmerten PH bei Pafah2-KO-Mäusen beobachtet (ergänzende Abbildung 3a – d). Der durch Hypoxie induzierte Umbau der Lungengefäße der Pafah2-KO-Mäuse war durch schwere perivaskuläre Fibrose gekennzeichnet, was durch die höheren Col1a1-mRNA-Spiegel sowie die Vimentin-positiven Bereiche in den Lungengefäßen angezeigt wurde (Abb. 2i, j). Darüber hinaus untersuchten wir den Phänotyp von PH unter Verwendung von PAF-AH-KO-Mäusen vom Plasmatyp (Pla2g7 KO), einem Enzym, das eine PAF-Acetylhydrolase-Enzymaktivität aufweist, die der von PAF-AH216,17 ähnelt, bei der es jedoch zu keinen schwerwiegenden Veränderungen des PH kam beobachtet (Abb. 2c–f, h). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die für PAF-AH2 einzigartigen Lipidmetaboliten, beispielsweise ω-3-Epoxide, eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der PH spielen.

Als nächstes identifizierten wir den Zelltyp, der für die Produktion von ω-3-Epoxiden in der Lunge verantwortlich ist. Die fluoreszierende Immunhistochemie von Lungenproben aus dem hypoxischen PH-Mausmodell, dem Sugen/Hypoxie-PH-Mausmodell und humanen idiopathischen PAH-Patienten ergab, dass es sich bei den Zellen, die PAF-AH2 exprimierten, um Tryptase-positive Mastzellen, nicht jedoch um Makrophagen, Fibroblasten, Endothelzellen und respiratorische Zellen handelte Epithelzellen (Abb. 3a, ergänzende Abb. 4a, b). In Übereinstimmung mit den Ergebnissen früherer Berichte18,19 wurde festgestellt, dass sich Mastzellen um Lungengefäße in PH-Lungen ansammeln (Abb. 3b).

a Repräsentatives Bild der Immunfärbung von PAF-AH2, Tryptase und CD31 in der Lunge von PH-Mäusen oder PAH-Patienten. SuHx; Sugen/Hypoxie. Maßstabsbalken, 50 μm. b Repräsentatives Bild der Toluidinblau-Färbung von Lungenschnitten bei PH-Mäusen, PH-Ratten oder PAH-Patienten. Pfeile zeigen Toluidinblau-positive Mastzellen. V-Gefäßlumen, MCT Monocrotalin. Maßstabsbalken, 50 μm. c Schematische Darstellung von Kit W-sh/W-sh-Mäusen, rekonstituiert mit PH-behandelten BMMCs. RHC-Rechtsherzkatheterisierung. d Repräsentatives Bild der EVG-Färbung von Lungenarteriolen in Kit W-sh/W-sh-Mäusen, rekonstituiert mit WT-BMMCs (WT → W-sh) oder Pafah2-KO-BMMCs (Pafah2 KO → W-sh), nach 4 Wochen hypoxischer Exposition. Maßstabsbalken, 50 μm. e–g Die Bewertung des PH-Schweregrades von BMMC-rekonstituierten Kit W-sh/W-sh-Mäusen, die Hypoxie ausgesetzt waren (n = 5,7). Wandstärke der Lungenarteriolen (e), RVSP (f), Gewichtsverhältnis von RV zu LV + Septum (g). Die Experimente wurden zweimal wiederholt und die Daten gepoolt (f, g). Relative mRNA-Spiegel von Nppa in RV (h) und Col1a1 in der Lunge (i) von BMMC-rekonstituierten Kit W-sh/W-sh-Mäusen, die Hypoxie ausgesetzt waren. (n = 4,5). Die Expressionsniveaus wurden auf die der ribosomalen 18S-RNA und dann auf die im RV oder in der Lunge von WT → W-sh-Mäusen normalisiert. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. Die P-Werte wurden durch den zweiseitigen Student-T-Test bestimmt.

Um festzustellen, ob PAF-AH2-exprimierende Mastzellen zum schweren PH-Phänotyp bei Pafah2-KO-Mäusen beitrugen, präparierten wir Mäuse mit Mastzellmangel (Kit W-sh/W-sh) und rekonstituierten sie mit aus dem Knochenmark stammenden Mastzellen (BMMCs). ) von WT-Mäusen oder Pafah2-KO-Mäusen. Anschließend haben wir diese Mäuse 4 Wochen lang einer Hypoxie ausgesetzt (Abb. 3c). 4 Wochen nach der BMMC-Injektion konnte eine ausreichende Anzahl Tryptase-positiver, PAF-AH2-positiver Mastzellen in der Lunge der rekonstituierten Mäuse bestätigt werden (ergänzende Abbildung 4c, d). Wie erwartet zeigten mit Pafah2-KO-BMMCs rekonstituierte Kit W-sh/W-sh-Mäuse im Vergleich zu mit WT-BMMCs rekonstituierten Mäusen einen schweren PH-Phänotyp (Abb. 3d – i), was darauf hindeutet, dass die PAF-AH2-Aktivität im Mast fehlt Zellen waren für den Phänotyp der Pafah2-KO-Mäuse unter hypoxischen Bedingungen verantwortlich.

Es ist bekannt, dass Omega-3-Epoxide die IgE-abhängige Degranulation in Mastzellen fördern15. Wir untersuchten, ob die Hypoxie-induzierte Degranulation von Mastzellen durch die Anwesenheit oder Abwesenheit von PAF-AH2 in vivo beeinflusst wurde. Während Hypoxie die Mastzellen in der Lunge erhöhte und deren Degranulation leicht verstärkte, zeigten die Gesamtzahl und die Degranulationsrate der Mastzellen in der Lunge weder unter Normoxie noch unter Hypoxie einen signifikanten Unterschied zwischen den WT-Mäusen und Pafah2-KO-Mäusen (ergänzende Abbildung). 5a, b). Darüber hinaus war die hypoxieabhängige Degranulation von BMMCs, die durch β-HEX-Freisetzung in vitro bestimmt wurde, zwischen den WT-BMMCs und Pafah2-KO-BMMCs nahezu vergleichbar (ergänzende Abbildung 5c).

Um zu untersuchen, ob die Degranulation von Mastzellen die Verschlimmerung des hypoxischen PH in Abwesenheit von PAF-AH2 in vivo vermittelte, untersuchten wir die Verbesserung des hypoxischen PH bei Pafah2-KO-Mäusen bei Verabreichung von Ketotifen, einem Mastzellstabilisator, der dessen Degranulation hemmt . Obwohl Ketotifen die hypoxieabhängige Degranulation der Mastzellen in der Lunge signifikant unterdrückte (ergänzende Abbildung 5d), zeigten die Pafah2-KO-Mäuse unabhängig von der Ketotifen-Behandlung eine schwere PH (ergänzende Abbildung 5e – g), was darauf hinweist, dass eine Degranulation der Mastzellen vorlag nicht an dem Mechanismus beteiligt, der der schweren PH zugrunde liegt, die durch das Fehlen von PAF-AH2 verursacht wird.

Da Mastzellen unabhängig von der IgE-Antigen-Stimulation auch unter Ruhebedingungen ω-3-Epoxide absondern15, stellten wir die Hypothese auf, dass die ω-3-Epoxide aus Mastzellen auf parakrine Weise auf die konstitutiven Zellen der Lungenarterie, insbesondere perivaskuläre Fibroblasten, einwirkten und diese kontrollierten die bei Hypoxie-exponierten Pafah2-KO-Mäusen signifikant aktiviert wurden (Abb. 2i, j). Um den Einfluss der von Mastzellen freigesetzten Lipide auf Lungenfibroblasten zu untersuchen, fügten wir Lipidextrakte der aus den Kulturüberständen von BMMCs isolierten freien Fettsäurefraktion zu primär kultivierten murinen Lungenfibroblasten hinzu. Die Lipidextrakte aus den Pafah2-KO-BMMCs erhöhten die Proliferation von Fibroblasten und die mRNA-Expression von Fibroblasten-Aktivierungsmarkern, einschließlich Col1a1 und Acta2, im Vergleich zu den Überständen der WT-BMMCs. Die additive Behandlung mit ω-3-Epoxiden unterdrückte die aberrante Proliferation und Hochregulierung der Aktivierungsmarkergene in den Fibroblasten, die mit Lipidextrakten aus den Pafah2-KO-BMMCs stimuliert wurden (Abb. 4a, ergänzende Abb. 6a). Die Proliferation von Lungenfibroblasten wurde durch Behandlung mit ω-3-Epoxiden, 17,18-EpETE oder 19,20-EpDPE unterdrückt, nicht jedoch durch EPA, DHA oder deren Dihydrodiole (Abb. 4b, ergänzende Abb. 6b). Wir konzentrierten uns auf die TGF-β-Signalübertragung, die eng mit der Gewebefibrose und der Pathophysiologie von PAH1,20 zusammenhängt, und untersuchten die Wirksamkeit von ω-3-Epoxiden auf Lungenfibroblasten. Die Behandlung mit ω-3-Epoxiden unterdrückte die mRNA-Expression von Col1a1, Acta2 und Il6 (Abb. 4c) und die Expression von SM22α, einem Myofibroblastenmarker, in den Lungenfibroblasten unter TGF-β-stimulierten Bedingungen signifikant (Abb. 4d). Dies deutet darauf hin, dass ω-3-Epoxide die Aktivierung von Fibroblasten unterdrückten. Darüber hinaus zeigten ω-3-Epoxide auch eine hemmende Wirkung auf die Migration von Lungenfibroblasten (ergänzende Abbildung 6c). Die andere epoxidierte Fettsäure, ein ω-6-Epoxid einschließlich 14,15-EET, zeigte keine hemmende Wirkung auf TGF-β-aktivierte Lungenfibroblasten (ergänzende Abbildung 7a, b). Es wurde bestätigt, dass ω-3-Epoxide die Phosphorylierung von Smad2, einem vorgeschalteten Substrat des TGF-β-Signalwegs, hemmten, was darauf hindeutet, dass dieser Weg einer der Wirkmechanismen ist (Abb. 4e).

a Relative Anzahl von Lungenfibroblasten, die durch Lipidextrakte aus Kulturmedium von BMMCs stimuliert werden, wenn sie 48 Stunden lang mit oder ohne ω-3-Epoxide (1 μM) behandelt werden (n = 4). Die Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige experimentelle Replikate. b Relative Anzahl der mit Vehikel behandelten Lungenfibroblasten, 17,18-EpETE (1 μM), 17,18-diHETE (1 μM), 19,20-EpDPE (1 μM), 19,20-diHDoPE (1 μM), EPA (1 μM) oder DHA (1 μM) für 48 Stunden (n = 4). Die Daten sind repräsentativ für 3 unabhängige experimentelle Replikate. c Relative Expressionsniveaus von Col1a1-, Acta2- und Il6-mRNA in Lungenfibroblasten, die 6 Stunden lang mit Vehikel, 17,18-EpETE (1 μM) oder 19,20-EpDPE (1 μM) behandelt wurden, bei Stimulation mit oder ohne TGF-β (2,5 ng/ml) (n = 4). Die Expressionsniveaus wurden auf die der ribosomalen 18S-RNA und dann auf die der unstimulierten Kontrollfibroblasten normalisiert. Die Daten sind repräsentativ für 3 unabhängige experimentelle Replikate. d Immunfärbung von SM22α in Lungenfibroblasten, behandelt mit Vehikel, 17,18-EpETE (1 μM), 19,20-EpDPE (1 μM), EPA (1 μM) oder DHA (1 μM) für 24 Stunden bei Stimulation mit oder ohne TGF-β (2,5 ng/ml) (links). Maßstabsbalken, 50 μm. Verhältnis von SM22α-positiven Zellen zu den gesamten Lungenfibroblasten (rechts) (n = 4). Die Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige experimentelle Replikate. e Western Blot von pSmad2, Smad2 und β-Actin in Gesamtproteinextrakten aus Lungenfibroblasten bei Verabreichung von Vehikel, 17,18-EpETE (1 μM) oder 19,20-EpDPE (1 μM) mit oder ohne TGF-β-Stimulation (1 ng/ml und 2,5 ng/ml) für 15 Minuten (links) und Quantifizierung durch Densitometrie (rechts). Die Experimente wurden dreimal wiederholt und die Daten gepoolt. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. Die P-Werte wurden durch eine einfaktorielle ANOVA mit dem Post-Hoc-Test von Dunnett (a–d) oder eine zweifaktorielle ANOVA mit dem Post-hoc-Test von Tukey (e) bestimmt.

Frühere Studien haben gezeigt, dass Anomalien in den Endothelzellen und glatten Muskelzellen der Lungenarterie maßgeblich an der Pathogenese von PAH1,2 beteiligt sind. ω-3-Epoxide hatten jedoch keinen Einfluss auf die Genexpression, die mit der Pathophysiologie von PAH in Endothelzellen der Lungenarterie verbunden ist (ergänzende Abbildung 8a) und übten keine antioxidative Wirkung auf Endothelzellen aus, um sie vor oxidativen Verletzungen zu schützen (ergänzende Abbildung 8b, c). ). Darüber hinaus wurde die Proliferation der glatten Muskelzellen der Lungenarterie durch die Behandlung mit den Lipidextrakten aus BMMCs (ergänzende Abbildung 8d) oder mit ω-3-Epoxiden (ergänzende Abbildung 8e) nicht beeinflusst.

Wir untersuchten auch einen Mechanismus, der die Expression von PAF-AH2 in Mastzellen reguliert. Wie in vivo in hypoxischen Lungen beobachtet (Abb. 2a), war die Pafah2-Expression auch in BMMCs herunterreguliert, wenn sie in vitro unter Hypoxie kultiviert wurden (ergänzende Abb. 9a), wohingegen die Expression von Cyp4a12, einem Enzym, das für die ω-3-Epoxidierung , in BMMCs verantwortlich ist blieb unverändert (Ergänzende Abbildung 9a). Bei Verabreichung mit Dimetyloxalyglycin (DMOG) oder CoCl2, Aktivatoren des Hypoxie-induzierbaren Faktors (HIF), war die Expression von Pafah2 in BMMCs verringert (ergänzende Abbildung 9b), was darauf hindeutet, dass PAF-AH2 durch HIF reguliert wurde.

Wir haben das therapeutische Potenzial von ω-3-Epoxiden für PAH validiert. In den PH-Mausmodellen mit chronischer Hypoxie wurde 19,20-EpDPE zwei Wochen nach der hypoxischen Exposition in einer Dosis von 0,05 mg/kg/Tag täglich durch intraperitoneale Injektion verabreicht. 19,20-EpDPE-Verabreichungen verbesserten den pH-Wert signifikant, indem sie den fortgeschrittenen Lungengefäßumbau, einschließlich perivaskulärer Fibrose, sowohl bei den WT-Mäusen als auch bei den Pafah2-KO-Mäusen unterdrückten, aber DHA oder ω-6-Epoxid, 14,15-EET, zeigten keine vorteilhaften Wirkungen (Abb. 5a – d, ergänzende Abb. 10a – d).

a Repräsentatives Bild der EVG-Färbung (oben) und der Immunfärbung von Vimentin und CD31 (unten) in der Lunge von Hypoxie-exponierten WT-Mäusen und Pafah2-KO-Mäusen bei Verabreichung von PBS, DHA (0,05 mg/kg/Tag) oder 19,20-EpDPE (0,05 mg/kg/Tag) ip jeden Tag. Mit diesen Verabreichungen wurde 2 Wochen nach der hypoxischen Exposition begonnen. Maßstabsbalken, 50 μm. b–d Die Bewertung des PH-Schweregrades bei Hypoxie-exponierten WT-Mäusen und Pafah2-KO-Mäusen bei Verabreichung von PBS, DHA oder 19,20-EpDPE (WT-Mäuse, n = 6,6,7; Pafah2-KO-Mäuse, n = 7, 6,7). Wandstärke der Lungenarteriolen (b), RVSP (c), Gewichtsverhältnis von RV zu LV + Septum (d). Die Experimente wurden zweimal wiederholt und die Daten gepoolt (c, d). e Repräsentatives Bild der EVG-Färbung (oben) und der Immunfärbung von Vimentin und CD31 (unten) in der Lunge von mit Sugen/Hypoxie behandelten WT-Mäusen, denen Vehikel, DHA (0,05 mg/kg/Tag) oder 19,20-EpDPE (0,05 mg) verabreicht wurden /kg/Tag) ip jeden Tag. Mit diesen Verabreichungen wurde 3 Wochen nach der hypoxischen Exposition begonnen. Maßstabsbalken, 50 μm. f–h Die Bewertung des PH-Schweregrades bei mit Sugen/Hypoxie behandelten WT-Mäusen, denen PBS, DHA oder 19,20-EpDPE verabreicht wurde (n = 6,5,6). Wandstärke der Lungenarteriolen (f), RVSP (g), Gewichtsverhältnis von RV zu LV + Septum (h). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. Die P-Werte wurden durch eine einfache ANOVA mit dem Post-Hoc-Test von Dunnett bestimmt.

Darüber hinaus untersuchten wir die Wirksamkeit von ω-3-Epoxiden in einem Sugen/Hypoxie-PH-Mausmodell, das einen schwerwiegenderen PH-Phänotyp aufwies. Die Verabreichung von 19,20-EpDPE, jedoch nicht von DHA, schwächte den Schweregrad der PH bei den Sugen/Hypoxie-Mäusen ab (Abb. 5e – h), wie im chronisch hypoxischen PH-Modell beobachtet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine In-vivo-Supplementierung mit ω-3-Epoxiden eine sinnvolle Behandlung für PH sein könnte.

Um zu untersuchen, ob Anomalien von PAF-AH2 an der Entwicklung von PAH beim Menschen beteiligt sind, haben wir mithilfe der Sequenzierung des gesamten Exoms bei PH-Patienten nach pathogenen Varianten in Pafah2 gesucht. Wir analysierten Blutproben von 262 Patienten, darunter 90 idiopathische PAH, 61 erbliche PAH und 54 mit Bindegewebserkrankungen assoziierte PAH (Ergänzungstabelle 1). Wir fanden zwei wichtige Varianten von Pafah2, p.Arg85Cys (R85C)/c.253C>T und p.Gln184Arg (Q184R)/c.551A>G, von denen angenommen wurde, dass sie bei drei PAH-Patienten hoch pathogen sind (Ergänzungstabelle 2). . Diese SNPs wiesen hohe CADD-Werte (Combined Annotation Dependent Depletion) auf, die auf eine hohe Pathogenität hindeuteten. Außerdem wurden diese Varianten an einer anderen Stelle als den katalytischen Stellen von Pafah2 gefunden (Abb. 6a). Unter Verwendung des Homologiemodells von PAF-AH2-Proteinen als Ausgangsmodell wurde gezeigt, dass simulierte PAF-AH2 p.R85C- und PAF-AH2 p.Q184R-Varianten Konformationsänderungen im Vergleich zum nativen Protein aufweisen (Abb. 6b). Darüber hinaus untersuchten wir die Auswirkungen der Pafah2-Varianten, indem wir die mutierten Proteine ​​mithilfe von pcDNA-Vektoren in vitro exprimierten. Die Konzentrationen der mutierten Proteine, PAF-AH2 p.R85C und p.Q184R, waren im Vergleich zu denen des nativen PAF-AH2 deutlich reduziert, aber die Konzentration von PAF-AH2 S236C, einer Variante an der katalytischen Stelle, blieb unverändert ( Abb. 6c). Interessanterweise wurden durch die Behandlung mit MG132, einem Proteasom-Inhibitor, die Proteinspiegel von PAF-AH2 p.R85C und p.Q184R teilweise wiederhergestellt (Abb. 6c), was darauf hindeutet, dass der Proteinabbau auf das Ubiquitin-Proteasom-System zurückzuführen ist. Insgesamt wurde angenommen, dass die bei PAH-Patienten gefundenen Pafah2-Varianten p.R85C und p.Q184R zum Fortschreiten der PH beitragen, indem sie die Anfälligkeit des PAF-AH2-Proteins für den Abbau erhöhen.

a Schematische Darstellung der Positionen von zwei pathogenen Mutationskandidaten im menschlichen Pafah2-Gen. b Das Strukturmodell der PAF-AH2 p.R85C-Variante (gelb links), p.Q184R-Variante (gelb rechts) und der nativen Form (blau), das die gestapelten Schnappschüsse von 300 Frames zeigt, die aus Frame 2700–3000 (entsprechend) erhalten wurden 54–60 Nanosekunden). Pfeile zeigen die veränderte Konformation in jedem Variantenmodell im Vergleich zum nativen Formmodell. c Western Blot von PAF-AH2 in HEK 293-Zellen, die humane Pafah2-Varianten exprimieren, unter Verwendung von pcDNA-Vektoren bei Behandlung mit oder ohne MG132 (10 μM) für 6 Stunden (oben) und Quantifizierung durch Densitometrie (unten). Die Experimente wurden viermal wiederholt und die Daten gepoolt. d Grafische Zusammenfassung. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. Die P-Werte wurden durch eine Zwei-Wege-ANOVA mit Tukeys Post-Hoc-Test bestimmt.

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass ω-3-Epoxide der Entwicklung von PH entgegenwirken, indem sie den Gefäßumbau der Lungenarterien regulieren. Dies basiert auf unseren Erkenntnissen, dass (a) die ω-3-Epoxide im Lungengewebe mit dem Fortschreiten der PH abnahmen, (b) die PH bei den Mäusen verschlimmert wurde, denen PAF-AH2, ein ω-3-Epoxid produzierendes Enzym, fehlte, und ( c) Die Ergänzung mit ω-3-Epoxiden schwächte den Schweregrad der PH in mehreren Krankheitsmodellen ab.

Epoxidierte Fettsäuren mit einem 3-Ring-Ether sind hochreaktive Lipide; Beispielsweise haben von Arachidonsäure abgeleitete epoxidierte Fettsäuren (Epoxyeicosanoid; EET) mehrere Funktionen, die verschiedene Prozesse beeinflussen, wie z. B. Angiogenese und Entzündungshemmung, die zur Aufrechterhaltung der Homöostase beitragen22,23,24. Andererseits ist bekannt, dass ω-3-Fettsäuren bioprotektive Wirkungen einschließlich Herzschutz haben25,26,27, und in den letzten Jahren wurde gezeigt, dass ihre Epoxidverbindungen starke einzigartige physiologische Wirkungen wie entzündungshemmende, gefäßerweiternde und tumoröse Wirkungen haben -unterdrückende Wirkung28,29,30,31,32,33,34. Interessanterweise konnte die in dieser Studie beobachtete antifibrotische Wirkung und Verbesserung des PH durch ω-3-Epoxide nicht bestätigt werden, wenn ω-3-Fettsäuren (EPA und DHA) in derselben Dosis verabreicht wurden, was darauf hindeutet, dass diese Funktionen spezifisch waren ω-3-Epoxide. Obwohl ihre Wirkungspunkte bisher nicht endgültig im Detail identifiziert wurden, könnte der TGF-β-Signalweg am zugrunde liegenden Mechanismus beteiligt sein, da 19, 20-EpDPE, ein ω-3-Epoxid, die Phosphorylierung von Smad2 deutlich unterdrückte stimuliert durch TGF-β, in Lungenfibroblasten.

Die Substratselektivität von PAF-AH und PAF-AH2 vom Plasmatyp ist ähnlich16. Zusätzlich zu PAF können beide PAF-AHs Phospholipide mit kurzer und/oder oxidierter sn-2-Fettacylkette hydrolysieren, aber kaum Phospholipide mit zwei langen Fettacylketten. Kürzlich wurde klar, dass beide PAF-AHs nicht fragmentierte oxidierte Phospholipide, wie z. B. F2-Isoprostan-haltige Phospholipide, langsam hydrolysieren können. Darüber hinaus kann PAF-AH vom Plasmatyp auch Phospholipidhydroperoxide hydrolysieren. Andererseits wurde kürzlich gezeigt, dass PAF-AH2 die einzigartige Aktivität besitzt, ω-3-Epoxide aus Phospholipiden freizusetzen15. Wir untersuchten den Schweregrad der hypoxischen PH bei Pla2g7-KO-Mäusen, es wurde jedoch kein signifikanter Unterschied zu WT-Mäusen beobachtet. Daher stellten wir fest, dass der verschärfte Phänotyp der hypoxischen PH spezifisch für Pafah2-KO-Mäuse war und dass die von PAF-AH2 produzierten ω-3-Epoxide in engem Zusammenhang mit der Schwere der PH standen. Über die Rolle von PAF-AH vom Plasmatyp bei hypoxischer PH wurde nie berichtet und ist nach wie vor relativ unbekannt. In dieser Studie ist die Überlebensrate von Pla2g7-KO-Mäusen mit hypoxischem PH nicht signifikant, aber schlechter als bei Kontrollmäusen mit hypoxischem PH (Abb. 2h), was darauf hindeutet, dass PAF-AH vom Plasmatyp zur Anfälligkeit gegenüber hypoxischem PH oder Hypoxie beitragen könnte selbst.

Auch die Zelltypspezifität unterscheidet sich zwischen den beiden Enzymen. PAF-AH vom Plasmatyp, das von Monozyten, Makrophagen und T-Lymphozyten sezerniert wird, wird überwiegend im makrophagenreichen Bereich in atherosklerotischen Plaques exprimiert35. Im Gegensatz dazu wird PAF-AH2 in Hepatozyten und renalen tubulären Epithelzellen exprimiert und in Mastzellen stark exprimiert36. Mastzellen enthalten eine beträchtliche Menge an PAF-AH2, was darauf hindeutet, dass dieses Enzym für die Funktionen von Mastzellen essentiell ist. Shimanaka et al. haben gezeigt, dass die von PAF-AH2 produzierten ω-3-Epoxide die Degranulation in Mastzellen fördern, die eine wichtige Rolle bei allergischen Entzündungen spielt15. Andererseits zeigte unsere Studie, dass ω-3-Epoxide aus Mastzellen eine bioprotektive Rolle in der Lunge spielten, wenn sie Hypoxie ausgesetzt waren. Darüber hinaus haben Shimanaka et al. berichteten, dass ω-3-Epoxide innerhalb der Mastzellen wirken15; Während unserer Studie wurden sie aus der Zelle freigesetzt, um auf andere umliegende Zellen einzuwirken. Da im Kulturüberstand der BMMCs ω-3-Epoxide nachgewiesen wurden, könnte man tatsächlich davon ausgehen, dass Mastzellen ω-3-Epoxide in den extrazellulären Raum freisetzten. Interessanterweise ist bekannt, dass Mastzellen selbst bei Hypoxie leicht degranulieren37, es wurde jedoch kein signifikanter Unterschied zwischen den WT-BMMCs und den Pafah2-KO-BMMCs beobachtet, was darauf hindeutet, dass ω-3-Epoxide keinen Einfluss auf die Hypoxie-induzierte, IgE-unabhängige Degranulation hatten .

Mastzellen sind in der Lunge weit verbreitet, da sie die wichtigsten Entzündungszellen der Lunge sind und eng mit allergischen Reaktionen wie Asthma verbunden sind38. Es wurde berichtet, dass Mastzellen an der Pathogenese von PH beteiligt sind, und es wird angenommen, dass die Degranulation von Mastzellen Entzündungen fördert und PH verschlimmert18,19,39,40. Es ist jedoch bekannt, dass Mastzellen auch entzündungshemmende Eigenschaften besitzen41,42. Daher muss in Studien mit Mäusen mit Mastzellmangel noch geklärt werden, ob Mastzellen für PH vorteilhaft oder schädlich sind. In unserer Studie hatte die Verabreichung von Ketotifen, einem Unterdrücker der Degranulation von Mastzellen, keinen Einfluss auf den Schweregrad der hypoxischen PH bei Mäusen. Daher verschlimmerten Mastzellen unter den Bedingungen dieser Studie den pathologischen Zustand nicht durch Degranulation, sondern unterdrückten vielmehr das Fortschreiten der PH durch Freisetzung von ω-3-Epoxiden.

In den letzten Jahren wurden mehrere Tiermodelle für PH entwickelt, und die Einschränkungen jedes Modells sollten verstanden werden. Das PH-Modell, das allein auf Hypoxie beruht, lässt sich möglicherweise besser als PH der Gruppe III (PH aufgrund von Lungenerkrankungen und/oder Hypoxie) als als PH der Gruppe I (PAH) klassifizieren. Um in dieser Studie die Beziehung zwischen einem bestimmten Molekül und der Pathophysiologie von PH mithilfe genetisch veränderter Mäuse zu klären, verwendeten wir zunächst ein Single-Hit-Modell mit ausschließlich hypoxischer Stimulation. Die experimentellen Ergebnisse des hypoxischen PH-Modells könnten teilweise den gemeinsamen Mechanismus erklären, der PH zugrunde liegt. Es musste jedoch auch das Tiermodell verwendet werden, bei dem der Schweregrad und die Gewebeveränderungen denen der PH der Gruppe I ähnelten. Um die Bedeutung und Wirksamkeit der PAF-AH2-ω-3-Epoxidachse bei PAH zu demonstrieren, führten wir in der vorliegenden Studie Experimente durch, bei denen den Sugen/Hypoxie-PH-Mäusen ω-3-Epoxide verabreicht wurden.

Es wird angenommen, dass der Gefäßumbau bei PH hauptsächlich durch Anomalien in Gefäßendothelzellen und glatten Muskelzellen verursacht wird. Allerdings zeigten Pafah2-KO-Mäuse mit hypoxischem PH eine ausgeprägte perivaskuläre Fibrose, was darauf hindeutet, dass die Fibrose die Verschlimmerung des PH stark beeinflusste. Interessanterweise veränderten ω-3-Epoxide in vitro die Genexpression und Zellproliferation von Lungenarterien-Endothelzellen und glatten Muskelzellen nicht signifikant. Darüber hinaus waren Mastzellen, die ω-3-Epoxide an ihre Umgebung abgeben, im interstitiellen Raum um die Blutgefäße lokalisiert, was darauf hindeutet, dass die perivaskulären Fibroblasten das Ziel der ω-3-Epoxide waren.

In dieser Studie identifizierten wir mithilfe eines Vorhersageprogramms (CADD-Score >30; SIFT, schädlich; Polyphen; wahrscheinlich schädlich) aus Sequenzierungsdaten des gesamten Exoms bei PAH-Patienten Missense-Mutationen, die in engem Zusammenhang mit der Pathogenität von PH stehen. Die meisten Patienten mit diesen Mutationen sprachen schlecht auf bestehende Therapeutika, vor allem Vasodilatatoren, an. Darüber hinaus ergaben Experimente mit dem Expressionsvektor in kultivierten Zellen einen verringerten Spiegel exprimierter Proteine, der mit den beiden Mutationen verbunden ist. Die erzwungene Expression von PAF-AH2 in BMMC wurde mit dem Plasmidvektor versucht, war jedoch erfolglos. Daher wurden HEK293-Zellen, bei denen es sich um vom Menschen stammende Zellen handelt, die durch Transfektion eines Plasmidvektors eine ausreichende Menge an Zielprotein produzieren und eine geringe endogene Produktion von PAF-AH2-Protein aufwiesen, als transfizierte Zellen ausgewählt. Da die Behandlung mit einem Proteasom-Inhibitor die Spiegel der mutierten Proteine ​​wiederherstellt, gehen wir davon aus, dass posttranslationale Modifikationen wie die Ubiquitinierung an der durch Mutationen verursachten Reduzierung beteiligt sind. Zukünftig sollte eine Knock-in-Maus des menschlichen PAF-AH2 erzeugt werden, die diese Mutationen trägt, um festzustellen, ob sich PH auf natürliche Weise entwickeln oder eine Exazerbation zeigen würde.

Die Hauptbehandlung für PH umfasst die funktionelle Vasodilatation durch verschiedene therapeutische Wirkstoffe, einschließlich Prostaglandin I2, Stickstoffmonoxid und Phosphodiesterase-5-Hemmung; Es gibt jedoch keine grundlegenden krankheitsmodifizierenden Medikamente, die das Fortschreiten der PH unterdrücken können. Der Umbau der Lungenarterien, an dem Entzündungszellen wie Mastzellen beteiligt sind, gilt als zentraler Mechanismus der PH. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass von Lungenmastzellen produzierte ω-3-Epoxide Kandidaten für ein wirksames therapeutisches Medikament sind, das den Umbau der Lungengefäße unterdrückt. Wir hoffen, in Zukunft eine wertvolle Therapiemethode mit ω-3-Epoxiden entwickeln zu können, um den Umbau der Lungengefäße bei PAH-Patienten mit PAF-AH2-Mutationen zu unterdrücken, die mit Lungenarteriendilatatoren nicht wirksam behandelt werden können.

Alle Verfahren in der vorliegenden Studie entsprachen den Grundsätzen des von den US National Institutes of Health (NIH) veröffentlichten Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden vom Laboratory Animal Center der Keio University School of Medicine (Nr. D2012) genehmigt -021 und Nr. 15063).

Pafah2-KO-Mäuse wurden über 10 Generationen hinweg mit C57BL/6-Mäusen rückgekreuzt36. Pla2g7-KO-Mäuse (C57BL/6J-Hintergrund) wurden freundlicherweise von Dr. Stafforini (Universität von Utah) erhalten. Die männlichen Mäuse wurden für alle Experimente mit Ausnahme derjenigen in der ergänzenden Abbildung 3 verwendet. In allen Experimenten mit KO-Mäusen (7–10 Wochen) wurden alters- und geschlechtsangepasste C57BL/6J-Mäuse als Kontrollen verwendet. Mastzelldefiziente Kit-Mutantenmäuse (C57BL/6J-Kit W-sh/W-sh) wurden von den Jackson Laboratories gekauft. Alle Mäuse wurden in klimatisierten (23 °C) spezifischen, pathogenfreien Einrichtungen mit einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus und freiem Zugang zu Standard-Labornahrung (CE2; CLEA Japan Inc.) und Wasser an der Keio-Universität gehalten.

EPA, DHA, AA, 17,18-EpETE, 19,20-EpDPE, 17,18-diHETE, 19,20-diHDoPE, 14,15-EET und andere Fettsäuremetaboliten wurden von Cayman Chemical erhalten.

Das rechte Lungengewebe der Maus wurde entnommen und sofort in flüssigen Stickstoff gegeben. Nach der Gefrierzerkleinerung der Proben wurden die Lipide nach der Methode von Bligh und Dyer43 extrahiert. Die extrahierten Lösungen wurden mit einem Zentrifugalverdampfer getrocknet, in Methanol:Isopropanol = 1:1 gelöst und bei –20 °C gelagert. Fettsäuremetaboliten wurden durch Festphasenextraktion unter Verwendung von InertSep NH2-Säulen (GL Science) mit Deuterium-markiertem internen Standard (11(12)-EET-d11) weiter aus Geweben gereinigt. Kurz gesagt, InertSep NH2-Säulen wurden mit 6 ml Hexan vorkonditioniert und Lipide, die nach der Methode von Bligh und Dyer aus Geweben extrahiert wurden, wurden mit 500 μl Chloroform aufgetragen. Die Säulen wurden dann mit 6 ml Chloroform/Isopropanol (2/1, Vol./Vol.) gewaschen, gefolgt von der Elution mit Diethylether/Essigsäure (98/2, Vol./Vol.). Die extrahierten Lösungen wurden mit einem Zentrifugalverdampfer getrocknet, in Methanol:Isopropanol = 1:1 gelöst und bei –20 °C44 gelagert.

Zum Nachweis von Fettsäuremetaboliten wurden LC/ESI-MS-basierte Lipidomics-Analysen auf einem Shimadzu Nexera UPLC-System (Shimadzu) durchgeführt, das mit einem QTRAP 4500 Hybrid-Triple-Quadrupol-Linear-Ionenfallen-Massenspektrometer (AB SCIEX) gekoppelt war. Die chromatographische Trennung wurde auf einer ACQUITY UPLC HSS T3-Säule (2,1 × 100 mm, 1,8 µm; Waters) durchgeführt, die bei 40 °C gehalten wurde, unter Verwendung der mobilen Phase A (Wasser/Essigsäure (100/0,1, Vol./Vol.) mit 10 mM Ammoniumacetat ) und mobile Phase B (Acetonitril/Methanol (4/1, v/v) mit 10 mM Ammoniumacetat) in einem Gradientenprogramm (0–2 Min.: 90 % A; 2–10 Min.: 90 % A → 30 % A ; 10–24 Min.: 30 % A → 27 % A; 24–27 Min.: 1 % A; 27–32 Min.: 90 % A) mit einer Flussrate von 0,2 ml/min (0–10 Min.), 0,1 ml /min (10–15 min), 0,2 ml/min (15–24 min) und 0,5 ml/min (24–32 min). Die Instrumentenparameter waren wie folgt: Vorhanggas, 10 psi; Ionensprühspannung, –4500 V; Temperatur: 600 °C; Ionenquellengas 1, 70 psi; Ionenquellengas 2, 80 psi. Der spezifische Nachweis wurde durch MRM wie zuvor beschrieben durchgeführt15,44.

Im Mäusemodell mit chronischer Hypoxie wurden die Mäuse 4 oder 8 Wochen lang in einer hypoxischen Kammer (10 % O2) gehalten, die mit einem hypoxischen Luftgenerator (TEIJIN) betrieben und mit einem O2-Analysator (JIKO-255) überwacht wurde. Das Sugen/Hypoxie-Mäusemodell wurde gemäß einem früheren Bericht erstellt45. Kurz gesagt, 20 mg/kg VEGF-Inhibitor, Sugen (SU5416; S8442, Sigma-Aldrich), suspendiert in CMC (0,5 % [w/v] Carboxymethylcellulose-Natrium, 0,9 % [w/v] Natriumchlorid, 0,4 % [v/v] Polysorbat 80, 0,9 % [v/v] Benzylalkohol in entionisiertem Wasser) wurde Mäusen (C57BL/6J) am Tag 0, 7 und 14 subkutan injiziert. Die Mäuse wurden in einer hypoxischen Kammer gehalten ( 10 % O2) für 7 Wochen. Die Tiere erhielten eine Standarddiät. Die Studien wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.

Jede Maus wurde mit 1,5 % Isofluran auf einem Wärmebrett anästhesiert und auf Herzfrequenz und Elektrokardiogramm überwacht. Zur Messung des RVSP wurde ein Mikrospitzenkatheter (Millar) über die rechte Halsvene in den RV eingeführt. Hämodynamische Messungen wurden mit Lab Chart 8 (AD-Instrumente) analysiert. Das Herz wurde zur Beurteilung der RV-Hypertrophie [Gewichtsverhältnis von RV und (linker Ventrikel + Septum)] und der RNA-Extraktion entfernt, und die Lungen wurden für die morphometrische Analyse und RNA-Extraktion vorbereitet.

Von Mäusen erhaltene BM-Zellen wurden in IL-3-haltigem BMMC-Komplettmedium kultiviert, das DMEM, 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin, 100 IU/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 100 mM nichtessentielle Aminosäuren und 5 ng enthielt /ml Maus-rIL-3 zur Herstellung von BMMCs46. Nach 4–6 Wochen Kultur wurde mittels Durchflusszytometrie bestätigt, dass es sich bei >95 % der schwimmenden Zellen um Kit+ FcεRI+-Mastzellen handelte. Die Degranulation von BMMCs wurde anhand der Mengen an freigesetztem β-HEX in einem enzymatischen Test unter Verwendung von 4-Nitrophenyl-N-acetyl-β-glucosaminid bewertet.

Um konditionierte Medien aus BMMCs zu erhalten, wurden 1 × 107 BMMCs 2 Tage lang in IL-3-haltigem BMMC-Komplettmedium kultiviert. Neutrale Lipide, Phospholipide und freie Fettsäuren wurden aus den konditionierten Medien durch Festphasenextraktion unter Verwendung von Sep-Pak C18-Kartuschen (Waters) extrahiert. Kurz gesagt, das konditionierte Medium wurde auf Sep-Pak-Säulen gegeben und neurale Lipide wurden mit 10 ml Hexan eluiert. Anschließend wurden freie Fettsäuren mit 10 ml Methylformiat eluiert. Phospholipide wurden schließlich mit 10 ml Methanol eluiert. Die freie Fettsäurefraktion wurde als Experimente verwendet.

BMMCs (5 × 106 Zellen) wurden durch intravenöse Injektion in 6 Wochen alte männliche Kit W-sh/Wsh-Mäuse rekonstituiert. Vier Wochen nach der Rekonstitution wurden die Mäuse einer Hypoxie ausgesetzt, um PH zu induzieren. Die Verteilung und Reifung der rekonstituierten BMMCs in der Lunge wurden durch Toluidinblau-Färbung oder Fluoreszenz-Immunfärbung bewertet.

Ketotifenfumaratsalz (Sigma) wurde in H2O gelöst und Mäusen 4 Wochen lang unter hypoxischen Bedingungen oral verabreicht. Der Trinkwasserverbrauch bei Mäusen in der Ketotifen-verabreichten Gruppe unterschied sich nicht von denen in der Kontrollgruppe.

Toluidinblau-positive Mastzellen wurden im gesamten Lungenschnitt gezählt, wobei bei jeder Maus mindestens 20 Schnitte unter dem Lichtmikroskop gemessen wurden. Perivaskuläre Mastzellen wurden basierend auf der Extrusion sekretorischer Granula in granulierte und degranulierte Zellen eingeteilt18. Granulierte Mastzellen haben ein dichtes Zytoplasma, während degranulierte Mastzellen ein helles Zytoplasma mit leeren Stellen aufgrund der Absonderung sekretorischer Körnchen aufweisen. Ein Granulationsindex wurde als Verhältnis der Anzahl granulierter Mastzellen zur Anzahl degranulierter Mastzellen berechnet.

Die Lungen von Mäusen wurden entnommen, über die Luftröhre mit 4 % Paraformaldehyd bei einem Druck von 25 cmH2O aufgeblasen und dann in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Die Proben wurden in Paraffin eingebettet und in 4 μm dicke Schnitte geschnitten und mit Hämatoxilin-Eosin (HE), Elastica-van Gieson (EVG) und Toluidinblau-Färbung gefärbt. Mindestens 10 periphere Gefäße (<100 μm Durchmesser) mit einem annähernd zirkulierenden Profil wurden in jedem Lungenabschnitt zufällig ausgewählt und die prozentuale Wanddicke anhand der folgenden Formel analysiert: [(Gefäßdurchmesser – Gefäßlumen)/Gefäßdurchmesser] × 100. Alle Morphometrische Analysen wurden gleichzeitig und unabhängig von den Studienbedingungen durchgeführt.

Für die Immunhistochemie von Lungenparaffinschnitten wurde die Entnahme von Paraffinschnitten unter Verwendung einer Entnahmelösung (Target Retrieval Solution S1700, Dako) in einem kochenden Wasserbad für 20 Minuten durchgeführt. Die Schnitte wurden 30 Minuten lang auf Raumtemperatur abgekühlt. Nach dem Waschen wurden die Schnitte mit dem Primärantikörper (Anti-CD31 [E-AB-70021; Elabscience; 1:200] für Mausproben oder Anti-CD31 [ab182981; Abcam; 1:2000] für menschliche Proben) bei 4 inkubiert °C über Nacht. Der primäre Antikörper wurde mithilfe von Alexa488-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Invitrogen; 1:2000) sichtbar gemacht. Für die Gegenfärbung mit Vimentin wurde die Immunfärbung mit dem Anti-Vimentin (ab8978; Abcam; 1:200) und dem MOM-Fluorescein-Immundetektionskit mit Avidin/Biotin-Blockierungskit (Vector Laboratories) und Streptavidin Texas Red (Vector Laboratories) gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt Protokoll. Für die Gegenfärbung mit Tryptase und PAF-AH2 wurde eine Immunfärbung unter Verwendung des Anti-Tryptase-Kits (NPB2-26444; Novus; 1:100) und des MOM-Fluorescein-Immundetektionskits mit Avidin/Biotin-Blockierungskit und Streptavidin AMCA (Vector Laboratories) durchgeführt. Der monoklonale Anti-PAF-AH2 TI10-Antikörper36 (1:100) wurde mit dem HiLyte Fluor 555 Labeling Kit (Dojindo Molecular Technologies) markiert. Die Schnitte wurden mit Fluoromount-G mit DAPI (Invitrogen) oder Fluoromount (Diagnostic BioSystems) montiert. Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (BZ-9000; Keyence) aufgenommen.

Für „Ergänzende Abbildungen“ wurde eine Immunfärbung von Paraffinschnitten der murinen Lunge unter Verwendung der Primärantikörper (Anti-Podoplanin; AF3244; R&D Systems; 1:40, Anti-Mac3; 550292; BD Biosciences; 1:100 und Anti-Vimentin; ab92547; Abcam; 1:200) und visualisiert unter Verwendung von Alexa 546-konjugiertem Esel-Anti-Ziegen-IgG, Alexa546-konjugiertem Ziegen-Anti-Ratten-IgG bzw. Alexa 594-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Invitrogen; 1:2000). Für die Gegenfärbung mit PAF-AH2 wurde eine Immunfärbung unter Verwendung des monoklonalen Anti-PAF-AH2 TI10-Antikörpers (1:100) und eines MOM-Fluorescein-Immundetektionskits mit Avidin/Biotin-Blockierungskit und Fluorescein-Avidin DCS (Vector Laboratories) durchgeführt. Bei der Immunfärbung menschlicher Lungenparaffinschnitte werden die primären Antikörper (Anti-Podoplanin; AF3670; R&D Systems; 1:100, Anti-CD68; #76437; Cell Signaling Technology; 1:200 und Anti-Vimentin; ab92547; Abcam; 1) verwendet :200) wurden durch Alexa594-konjugiertes Esel-Anti-Schaf-IgG bzw. Alexa594-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Invitrogen; 1:2000) verwendet und visualisiert. Für die Gegenfärbung mit PAF-AH2 wurden Anti-PAF-AH2 TI10-Antikörper (1:100) und Alexa 488-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:2000) verwendet.

Primäre Lungenfibroblasten, die auf einer 35-mm-Glasbodenschale (Iwaki) ausgesät wurden, wurden mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und mit 0,2 % Triton X-100 10 Minuten lang permeabilisiert und dann eine Stunde lang mit 1 % Serum blockiert. Die Zellen wurden über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern gefärbt. Alexa488-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen/Maus-IgG (Invitrogen; 1:2000) wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und gleichzeitig mit DAPI gefärbt. Die in der vorliegenden Studie verwendeten Primärantikörper waren Anti-SM22α (ab14106; Abcam; 1:100) und Anti-PCNA (ab29; Abcam; 1:100). Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (BZ-9000; Keyence) aufgenommen.

Die Lungen wurden mit Kollagenase II (Worthington Biochemical Crop) perfundiert und verdaut. Dissoziierte Zellen wurden eine Stunde lang inkubiert. Die verbleibenden Zellen wurden in DMEM (Wako), das 10 % fötales Rinderserum enthielt, resuspendiert und auf Primaria-Kulturschalen (BD) gegeben. Nach 24 Stunden wurde das Kulturmedium gewechselt. Nach weiteren 3 Tagen und 5 Tagen wurden die Fibroblastenkulturen passagiert und in den Experimenten verwendet.

Lungenfibroblasten und glatte Muskelzellen wurden auf 96-Well-Platten ausgesät. Nach 12 Stunden wurden ω-3-Epoxide oder Lipidextrakte zu den Platten gegeben und Zellproliferationen wurden 48 Stunden lang unter Verwendung des RealTime-Glo MT Cell Viability Assay (Promega) auf einem Mikroplattenlesegerät (Gen5 Synergy HTX; BioTek Instruments) beobachtet ).

Die Zellmigration wurde unter Verwendung eines Boyden-Kammer-Assays mit Membraninvasionskammern mit 24 Vertiefungen und 8 μm Porengröße (ThermoFisher) durchgeführt. 2 × 104 Zellen wurden in die obere Kammer des Transwells ausgesät. In die untere Kammer wurden Omega-3-Epoxide oder ω-3-Fettsäuren gegeben. Nach 24 Stunden wurden Membranen mit migrierten Zellen mit Methanol fixiert und mit Toluidinblau angefärbt. Die Bilder wurden mit einem Mikroskop (BZ-9000; Keyence) aufgenommen und die Anzahl der wandernden Zellen wurde durch 10-fache Zufallsfelder quantifiziert.

Menschliche Lungenendothelzellen (Gibco) wurden unter 5 % CO2 bei 37 °C unter Verwendung von EGM-2 BulletKit-Medium (CC-3162; Lonza) kultiviert. Menschliche pulmonale arterielle glatte Muskelzellen (Kurabo) wurden ebenfalls unter Verwendung von DMEM (Wako), das 20 % fötales Rinderserummedium enthielt, kultiviert. Zwischen den Passagen 4 und 8 wurden Zellen verwendet.

Messungen der interzellulären Konzentrationen reaktiver Sauerstoffspezies wurden mit dem Cellular ROS Assay Kit (abcam) durchgeführt. Endothelzellen der menschlichen Lungenarterie wurden auf 96-Well-Platten ausgesät. Nach 12 Stunden wurden ω-3-Epoxide oder ω-3-Fettsäuren mit oder ohne H2O2-Stimulation (500 μM oder 1 mM) zu den Platten gegeben. Eine Stunde später wurde 2′,7′-Dichlorfluorescindiacetat zu den Platten gegeben und 2′,7′-Dichlorfluorescin durch Fluoreszenzspektroskopie mit Anregung/Emission bei 485 nm/535 nm auf einem Mikroplattenlesegerät (Gen5 Synergy HTX; BioTek) gemessen Instrumente).

Endothelzellen der Lungenarterie wurden auf Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät. Nach 12 Stunden wurden ω-3-Epoxide oder ω-3-Fettsäuren mit oder ohne H2O2-Stimulation (500 μM oder 1 mM) zu den Platten gegeben. Zwei Stunden später wurde die Anzahl lebensfähiger Zellen mithilfe des CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) auf einem Mikroplattenlesegerät (Gen5 Synergy HTX; BioTek Instruments) gemessen.

Wir verwendeten die pcDNA3.1(+)-Plasmidvektoren (V790202, Invitrogen), die eine menschliche Pafah2-cDNA voller Länge (NCBI-Referenzsequenz: NM_000437.4) tragen, die aus der cDNA-Bibliothek des menschlichen Gehirns (Life Technologies, Inc.) kloniert wurde47. Unter Verwendung des Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent) gemäß der Bedienungsanleitung führten wir eine Einzelbasensubstitution in das Plasmid ein, das native Pafah2-cDNA trägt, um die Varianten R85C (253C>T), Q184R (551A>G) und S236C zu erzeugen (707C>G) und bestätigte das Vorhandensein von Mutationen durch DNA-Sequenzierung. Native oder mutierte Pafah2-pcDNA-Plasmide (3,5 μg pro 6-Well-Schale) wurden unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen) in HEK293-Zellen transfiziert. Nach 48 Stunden wurde das Kulturmedium gewechselt und DMEM mit oder ohne MG132 (10 μM) 6 Stunden lang ausgesetzt. Anschließend wurden Zellen gesammelt und die Menge des exprimierten PAF-AH2-Proteins durch Western Blot analysiert. Als Kontrollen wurden mit leeren pcDNA-Vektoren transfizierte HEK293-Zellen verwendet.

Gleiche Mengen des Gesamtproteins, das aus Mäuselungen, primär kultivierten Fibroblasten oder HEK293-Zellen isoliert wurde, wurden in Radioimmunpräzipitations-Assay-Puffer hergestellt, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1 % Nonidet-P40, 0,5 % Natriumdesoxycholat enthielt. und 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) und ergänzt mit 1 mM Dithiothreitol (DTT), 100 nM MG132, Protease-Inhibitor-Cocktail und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (Nacalai Tesque). Für die Western-Blot-Analyse wurden gleiche Mengen des Gesamtproteins (10–15 μg) aus dem Lysat einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Die in der vorliegenden Studie verwendeten Primärantikörper waren Anti-PAF-AH2 (TI10; 1:1000), Anti-β-Actin (sc-47778; Santa Cruz Biotechnology; 1:1000) und Anti-p-Smad 2 S465/467 (#3108) und Anti-Smad 2 (#5339) (Cell Signaling Technology; 1:1000). Proteinbanden wurden mithilfe von Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörpern (1:2000) und verstärkter Chemilumineszenz (Chemi-Lumi One Super; Nacalai Tesque) auf einem LAS-4000 mini (GE Healthcare) sichtbar gemacht. Proteinbanden wurden mit ImageJ ver1.52 quantifiziert.

Für die quantitative Echtzeit-PCR wurden Gesamt-RNA-Proben aus Lungen, RV oder Lungenfibroblasten unter Verwendung von Trizol-Reagenz (Invitrogen) hergestellt. Proben der Gesamt-RNA (0,2–0,5 μg) wurden mit dem High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) revers transkribiert. Die quantitative mRNA-Expression wurde durch Echtzeit-PCR unter Verwendung des THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (Toyobo) bewertet. Die Proben wurden auf dem ViiA7 (Applied Biosystems) analysiert und die Daten mit der Delta-Delta-CT-Methode analysiert. Die ribosomale 18S-RNA wurde amplifiziert und als interne Kontrolle verwendet. Die Primersequenzen für Gene sind in der Ergänzungstabelle S3 aufgeführt.

Diese Studie wurde vom Institutional Review Board (IRB) des Keio-Universitätskrankenhauses (IRB-Nr.: 20140203) genehmigt und alle Gentests wurden mit Einverständniserklärung der Patienten nach genetischer Beratung durchgeführt. Wir haben Blutproben von 262 Patienten eingeschlossen und analysiert, darunter 90 idiopathische PAH, 61 erbliche PAH und 54 mit Bindegewebserkrankungen assoziierte PAH (Durchschnittsalter 45,5 ± 16,6 Jahre; weiblich 78,0 %; mittlerer Lungenarteriendruck 42,9 ± 15,5 mmHg). . Wir führten eine Sequenzierung des gesamten Exoms unter Verwendung einer HiSeq 2500-Plattform (Illumina, San Diego, CA) und eines SureSelectXT Human All Exon Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) zur Hybridisierungserfassung durch. Die Pathogenität der Varianten wurde mit CADD, SIFT und PolyPhen-248,49 bewertet. Im Hinblick auf Varianten des Pafah2-Gens in den Sequenzierungsdaten des gesamten Exoms von Patienten mit PH haben wir Missense-Mutationen mit einem CADD-Score von mindestens 30 (MIS30) ausgewählt. Zu den bekannten Genen, die mit pulmonaler arterieller Hypertonie (PAH) in Zusammenhang stehen, gehören das Bone Morphogenetic Protein Receptor Type 2-Gen (BMPR2), das Activin A-Rezeptor-ähnliche 1-Gen (ACVRL1), das Endoglin-Gen (ENG), das Caveolin-1-Gen (CAV-1) und das T -Box-4-Gen (TBX4), Kaliumkanal-Subfamilie-K-Mitglied-3-Gen (KCNK3), eukaryotischer Initiationstranslationsfaktor 2 a Kinase 4 (EIF2AK4), SMADs, Adenosintriphosphat 13A3 (ATP13A3), Aquaporin-1-Gen (AQP1), Wachstumsdifferenzierungsfaktor 2-Gen (GDF2) und SRY-verwandtes High-Mobility-Group-Box-Familienmitglied 17-Gen (SOX17), die gemäß dem vorherigen Bericht ausgewählt wurden48.

Das ursprüngliche 3D-Strukturmodell von PAF-AH2 wurde mithilfe der Homologiemodellierung mit dem SWISS-MODEL50 erhalten. Als Vorlage wurde die Kristallstruktur von PAF-AH vom Plasmatyp (PDB-Nummer: 5i9i.1.A) verwendet (Sequenzidentität 42,33 %, GMQE-Score 0,74)51. Die Molekulardynamiksimulation wurde unter wasserlöslichen Bedingungen unter Verwendung von Nanoscale Molecular Dynamics (NAMD) Version 2.1252 mit Chemistry at Harvard Molecular Mechanics (CHARMM) 36 Kraftfeld53 durchgeführt. Der Positions- und Geschwindigkeitsvektor jedes Atoms und Wassermoleküls wurde alle 2,0 Femtosekunden (1 × 10−15 s) berechnet und die Particle Mesh Ewald (PME)-Summierung mit einer Cut-Off-Länge von 12 Å für die direkten Wechselwirkungen wurde verwendet Vorhersage der elektrostatischen Wechselwirkung über große Entfernungen54. Die Simulation wurde mit den Optionen von rigibBonds all durchgeführt und das System wurde mit NaCl in physiologischem Zustand (150 mEq/l) neutralisiert. Die Wassermoleküle wurden als übertragbare intermolekulare Potentialwassermoleküle (TIP3P) modelliert. Die ursprüngliche Struktur jedes Mutanten wurde durch Induzieren der Aminosäuresubstitution gegen die ursprüngliche Struktur des Wildtyps in wasserlöslichem Zustand mithilfe des Mutate-Residuen-Plugins von Visual Molecular Dynamics (VMD) Version 1.9.352 erhalten. Die stabile Struktur jedes Mutanten zusammen mit dem Wildtyp wurde berechnet, indem die Simulation 72 Nanosekunden lang ausgeführt wurde. Die mittlere quadratische Abweichung (RMSD) wurde verwendet, um zu bestätigen, dass sich die Berechnung stabilisiert hat (ergänzende Abbildung 11a – c). Der RMSD wurde mit Abständen relativ zum ursprünglichen Modell berechnet. Während das ursprüngliche Modell des Wildtyps das unmittelbare Ergebnis der in Wasser solvatisierten Homologiemodellierung war, handelte es sich bei den ursprünglichen Modellen für die Mutanten um die stabile Struktur des Wildtyps (nach einer Simulation von 60 Nanosekunden). Alle Ergebnisse wurden mit VMD Version 1.9.3 visualisiert. Die Simulation wurde mit der Grenzgröße 7,37 nm × 8,34 nm × 8,22 nm und einer periodischen Randbedingung durchgeführt. Die Atomzahlen betrugen 46628, 46615 und 46635 für die Modelle WT, R85C und Q184R (einschließlich Wasser und Ionen). Die gestapelten Schnappschüsse von 300 Bildern, die von Bild 2700–3000 (entsprechend 54–60 Nanosekunden) erhalten wurden, einem Zeitfenster, das strukturelle Schwankungen nach der Stabilisierung des Modells darstellt, wurden als Zahlen dargestellt.

Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Der Z-Score der Lipidomics-Daten wurde mit Microsoft Excel 2019 berechnet und als Heatmap angezeigt. Die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen den beiden Gruppen wurde mithilfe des ungepaarten Student-T-Tests bestimmt. Unterschiede zwischen mehreren Gruppen wurden mithilfe einer einfaktoriellen oder zweifaktoriellen ANOVA und anschließenden Post-hoc-Tests verglichen. Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism Version 9 durchgeführt. Ein Wert von P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel und seinen Zusatzinformationen verfügbar. Die Lipidomics-Daten wurden in Metabolomics Workbench unter der Zugangsnummer ST001951 (https://doi.org/10.21228/M8PH6J) hinterlegt. Die Kristallstruktur des in dieser Studie verwendeten PAF-AH vom Plasmatyp ist in der Proteindatenbank unter der PDB-Nummer 5I9I (https://www.rcsb.org/structure/5I9I) verfügbar. Die Daten zur Sequenzierung des gesamten Exoms sind nicht öffentlich verfügbar, da sie Informationen enthalten, die die Privatsphäre der Forschungsteilnehmer gefährden könnten. Um die pseudonymisierten Daten auf individueller Ebene zu erhalten, müssen Forscher das Hauptmitglied des Datenzugriffsausschusses (MK) unter [email protected] kontaktieren und wissenschaftlich angemessene Anfragen stellen. Insgesamt dürfen diese Daten nur für Forschungszwecke verwendet werden und stehen nicht für kommerzielle Zwecke zur Verfügung. Alle Anträge müssen den wissenschaftlichen Zweck, die Ziele, die Methoden, den Zeitplan, das Datenmanagement, ethische Überlegungen, finanzielle Angelegenheiten und konkurrierende Interessen detailliert beschreiben und außerdem einen Projektplan und Informationen über die für die Forschung verantwortliche Stelle sowie den Hauptforscher enthalten. Alle Anfragen werden vom IRB der Keio-Universität geprüft und erfordern, dass der anfragende Forscher eine Datenzugriffsvereinbarung mit der Keio-Universität unterzeichnet. Datenanfragen werden innerhalb eines Monats bearbeitet, wenn dem Autor eine schriftliche ethische Genehmigung vorgelegt wird. Die Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir möchten Yoshiko Miyake (Keio University) und Seiichi Kotoda (Unternehmen eines Bioforschungszentrums, Japan) für ihre hervorragende technische Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde von der Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) unter den Fördernummern JP22gm5910014 (JE) und JP22gm1210013 (NK), der SENSHIN Medical Research Foundation (JE), der Japan Research Foundation for Clinical Pharmacology (JE) und dem Keio University Grant unterstützt -Hilfe zur Förderung junger medizinischer Wissenschaftler (HM).

Abteilung für Kardiologie, Keio University School of Medicine, Tokio, Japan

Hidenori Moriyama, Jin Endo, Masaharu Kataoka, Shinichi Goto, Hiroki Kitakata, Takahiro Hiraide, Naohiro Yoshida, Sarasa Isobe, Tsunehisa Yamamoto, Kohsuke Shirakawa, Atsushi Anzai, Yoshinori Katsumata, Keiichi Fukuda und Motoaki Sano

Labor für Gesundheitschemie, Graduiertenschule für Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Tokio, Tokio, Japan

Yuta Shimanaka, Nozomu Kono und Hiroyuki Arai

Abteilung für Biochemie, Keio University School of Medicine, Tokio, Japan

Yuki Sugiura und Makoto Suematsu

Zentrum für medizinische Genetik, Keio University School of Medicine, Tokio, Japan

Kenjiro Kosaki

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HM und JE konzipierten und führten die Experimente durch, analysierten die Daten und verfassten das Manuskript. MK und TH sammelten die Patientenproben und analysierten die Daten. Y.Shimanaka, Y.Sugiura und NK führten eine umfassende Lipidomanalyse durch. SG führte eine Molekulardynamiksimulation durch. HK, NY, SI, TY, KS, AA und YK führten die Experimente durch und analysierten die Daten. KK führte eine Sequenzierung des gesamten Exsomes durch. M.Suematsu, KF, HA und M.Sano haben die Experimente entworfen und die Ergebnisse interpretiert.

Korrespondenz mit Jin Endo.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Mark Nicolls, Wen Tian, ​​Karsten Weylandt und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Moriyama, H., Endo, J., Kataoka, M. et al. Von PAF-AH2 in Mastzellen produzierte Omega-3-Fettsäureepoxide regulieren den Umbau der Lungengefäße. Nat Commun 13, 3013 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30621-z

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Eingegangen: 3. März 2021

Angenommen: 03. Mai 2022

Veröffentlicht: 31. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30621-z

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