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Aug 06, 2023

PEG2000

Wissenschaftliche Berichte Band 12,

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 10564 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Aufgrund unseres Interesses an der Nützlichkeit von Liposomen für die molekulare Bildgebung und Theranostik untersuchten wir, wie sich die Beschichtung der äußeren Schicht des Liposoms auf die Internalisierung durch Brustkrebszelllinien in vitro und in Brusttumorgeweben in vivo auswirkt. Tatsächlich haben wir herausgefunden, dass durch die weiche Beschichtung mit DBCO (Dibenzocyclooctin) eine bemerkenswert hohe liposomale Aufnahme erreicht werden kann. Unsere Daten zeigen, dass das Dekorieren des terminalen Lipids mit einer DBCO-Einheit in einer bestimmten Dichte im Vergleich zu herkömmlichen, nicht dekorierten Liposom (Tumoraufnahme ~ 20 %) eine erhöhte Tumoraufnahme in vivo induziert (Tumoraufnahme ~ 50 %). In dieser Studie berichten wir über eine verbesserte Visualisierung von Brustkrebszellen in vivo unter Verwendung eines orthotopen 4T1-Brustkrebsmodells und der primären Brusttumor-Xenotransplantatmodelle MDA-MB-231 und MDA-MB-436. Mit L-PEG2000-DBCO beschichtete Liposomen zeigen eine erhöhte Akkumulation in Brustkrebszellen, unabhängig von Tumorgröße, -typ, -position, Rezeptorexpression sowie dem Zustand der Wirtsmäuse. Wir gehen davon aus, dass diese Erkenntnisse einen großen positiven Einfluss auf den praktischen Nutzen von Liposomen in bildgesteuerten Anwendungen und in der Präzisionsmedizin-Theranostik haben werden.

Liposomen sind Lipidvesikel, die aus einer Lipiddoppelschicht bestehen, die einen wässrigen Kern umschließt, und gelten als eines der vielversprechendsten und wirksamsten Vehikel zur Arzneimittelabgabe1,2. Liposomen wurden in den letzten drei Jahrzehnten umfassend untersucht, um ihr klinisches Potenzial zu optimieren. Zu den erfolgreichsten Anwendungen von Liposomen bei der Arzneimittelabgabe gehören die beiden liposomalen Doxorubicin-Formulierungen (Doxil, Myocet), die unter anderem für den klinischen Einsatz bei Eierstockkrebs und multiplem Myelom zugelassen sind3,4,5. Trotz dieser Therapieerfolge liegt die klinische Entwicklung von Liposomen in der molekularen Bildgebung und in der bildgesteuerten Theranostik jedoch deutlich zurück. Bisher besteht die größte zu überwindende Einschränkung in der relativ geringen liposomalen Aufnahme durch Tumorgewebe. Es besteht ein ungedeckter Bedarf an neuen liposomalen Formulierungen, die eine hohe Tumoraufnahme ermöglichen können, um die klinische Umsetzung dieser erstaunlichen Nanoträger zu erleichtern.

Oberflächenmodifikationen ermöglichen das individuelle Design von Liposomen für diagnostische, therapeutische und bildgesteuerte Verabreichungsanwendungen6,7,8,9,10,11. Zu den einzigartigen Vorteilen von Liposomen gehören eine minimale Immunreaktivität, ein verringerter proteolytischer Abbau, längere Zirkulationszeiten und eine reproduzierbare Montage auf kostengünstige Weise. Infolgedessen sind Liposome geradezu magische Nanoträger-Werkzeuge für die Diagnose, Überwachung und Behandlung menschlicher Krankheiten12,13.

Aufgrund unseres Interesses an der klinischen Entwicklung von Liposomen für die molekulare Bildgebungs-Theranostik untersuchten wir, wie sich die Beschichtung der äußeren Schicht des Liposoms mit einer bestimmten Oberflächendichte auf die zelluläre Internalisierung in vitro und in vivo auswirkt. Tatsächlich haben wir herausgefunden, dass durch die weiche Beschichtung mit DBCO (Dibenzocyclooctin) in vitro und in vivo eine bemerkenswert hohe liposomale Aufnahme durch Tumorgewebe erreicht werden kann. Unsere Daten zeigen, dass das Dekorieren des terminalen Lipids mit einer DBCO-Einheit bei spezifischer Dichte im Vergleich zum herkömmlichen nicht dekorierten Liposom (Tumoraufnahme ~ 20 %) in vivo zu einer starken Tumoraufnahme führt (~ 50 %). In einem Tiermodell konnten wir eine erhöhte Aufnahme durch orthotope 4T1-Brustkrebszellen und Xenotransplantate aus den primären Brustkrebszelllinien MDA-MB-231 und MDA-MB-436 sichtbar machen. Unsere Ergebnisse stimmen mit jüngsten Erkenntnissen überein, dass Wechselwirkungen zwischen der liposomalen Oberfläche und der Zellmembran die Zellaufnahme erheblich beeinflussen. Ein besseres Verständnis darüber, wie die liposomale Oberfläche die Zellinternalisierungswege reguliert, bietet eine Chance für eine verbesserte intrazelluläre Arzneimittelabgabe14.

Unsere Erkenntnisse werden den Weg für die Entwicklung der nächsten Generation von Liposomen mit modifizierten Oberflächeneigenschaften ebnen, die eine effiziente Tumoraufnahme ermöglichen und wiederum ein enormes Potenzial für den klinischen Einsatz in der Präzisionsmedizin-Theranostik aufzeigen. Wir gehen davon aus, dass wir die Vorteile dieser verbesserten Liposomen für die präzise bildgesteuerte Chirurgie, die präzise Erkennung von Tumoren mit Positronen-Emissions-Tomographie (PET)-Radiotracern und die Tumorbehandlung durch präzise Abgabe radiotherapeutischer Nutzlast an den Primärtumor und seine Fernmetastasen nutzen können. Diese ehrgeizigen Studien laufen in unserem Labor und werden zu gegebener Zeit veröffentlicht.

Die Liposomen wurden wie in Abb. 1a dargestellt nach folgenden Schritten zusammengesetzt: Skelettlipide (DOPC), funktionelle Lipide (DSPE-PEG2000-DBCO oder DSPE-PEG2000) und bildgebende Materialien (DiI oder DiR) wurden in Chloroform gelöst und gebildet Dünnfilm, gefolgt von Rehydrierung, Extrusion und Dialyse. Die Größe und das Zetapotential betrugen ~ 95 nm bzw. − 4,8 mV (Tabelle S1). Die Oberflächenmorphologie von L-PEG2000-DBCO wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) abgebildet, wie in Abb. 1b gezeigt. Der Durchmesser von L-PEG2000-DBCO (L-DBCO) betrug ungefähr 96 nm mit einem Abstand von 25 Å zwischen benachbarten DBCO-Anschlüssen (Abb. 1b und Tabelle S1).

L-PEG2000-DBCO-Zusammenbau mit der gewünschten DBCO-Dichte: (a) Schema des liposomalen Zusammenbauverfahrens und (b) Die L-PEG2000-DBCO-Oberflächenmorphologie wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) abgebildet und die DBCO-Beschichtungsanordnung wird durch ein Kartonschema dargestellt um die mögliche Struktur der L-PEG2000-DBCO-Oberflächenmorphologie zu zeigen.

Wir nutzten Durchflusszytometrie und konfokale Mikroskopie in vitro, um zu zeigen, dass L-PEG2000-DBCO dem herkömmlichen L-PEG2000 überlegen ist. Wie erwartet wurden durch Durchflusszytometrie keine signifikanten Unterschiede in der Zellaufnahme zwischen L-PEG2000 (markiert mit DiI) und L-PEG2000-DBCO (markiert mit DiI) in der nicht-neoplastischen Zelllinie (Vero) beobachtet, wie in Abb. 2a gezeigt. Im Gegensatz dazu zeigte L-PEG2000-DBCO eine höhere Zellaufnahme in Brustkrebszellen: MCF-7, MDA-MB-231 und MDA-MB-436, wie in Abb. 2b – d dargestellt. Der Mittelwert der DiI-, L-PEG2000- und L-PEG2000-DBCO-Peaks für verschiedene Zellen ist in Tabelle S1 (Ergänzungsmaterial) aufgeführt. Die Signalintensität der L-PEG2000-DBCO-Färbung stieg bei MCF-7, MDA-MB-231 und MDA-MB-436 im Vergleich zu L-PEG2000 um 258 %, 303 % bzw. 255 %. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass beide liposomalen Formulierungen (markiert mit DiI) normale Zellen von Brustkrebszellen unterscheiden und dass sich L-PEG2000-DBCO besser in Brustkrebszellen anreichert als L-PEG2000. Darüber hinaus verwendeten wir konfokale Mikroskopie, um unsere Ergebnisse weiter zu bestätigen. Die Färbeintensität von L-PEG2000-DBCO stieg in MDA-MB-231-Zellen im Vergleich zu L-PEG2000 um 244 %, wie in Abb. 2e gezeigt.

Durchflusszytometrie- und konfokale Mikroskopiestudien unter Verwendung liposomaler Formulierungen, die mit DiI markiert sind (außer dass Scheinkulturen Kulturmedium darstellen): (a) nicht-neoplastische Zelllinie (Vero), (b) Her2/neu+ primäre Tumorzelllinie (MCF-7), ( c) Dreifach negative Brustkrebs-Zelllinie (TNBC) (MDA-MB-231), (d) Dreifach negative Brustkrebs-Zelllinie (TNBC) mit hohem Metastasierungspotenzial (MDA-MB-436) und (e) Konfokale Mikroskopie von Liposomen Formulierungen in MDA-MB-231-Zelllinien.

Wir nutzten die optische Bildgebung in vivo, um die oben genannten In-vitro-Daten weiter zu bestätigen und darauf aufzubauen. Wir haben die Leistung von L-PEG2000-DBCO und L-PEG2000 in einem kleinen orthotopen Tumor (15 ~ 25 mm3) getestet, um die Metastasenherde oder die Rückfallherde nach einer chirurgischen Resektion nachzuahmen16,17. Es wurde berichtet, dass das Tumorwachstum und die metastatische Ausbreitung von 4T1-Zellen bei BALB/c-Mäusen menschlichen Brustkrebs im Stadium IV nachahmen18. Tatsächlich zeigen die in Abb. 3a – c gezeigten Daten eine überlegene Tumoraufnahme von L-PEG2000-DBCO im Vergleich zum L-PEG2000-Liposom. Das L-PEG2000-DBCO weist eine bemerkenswert hohe Aufnahme in Tumorherde auf, nämlich bis zu 54 %, während die Leberaufnahme auf 16 % begrenzt war. Im Gegensatz dazu konnte L-PEG2000 diesen kleinen Tumor nicht erkennen, da 77 % des Liposoms in der Leber und im ER-System eingeschlossen waren (Abb. 3c, d). Die Akkumulationsrate der beiden liposomalen Formulierungen in Tumorgeweben ist in Abb. 3c, d dargestellt. Insgesamt zeigte L-PEG2000-DBCO im Vergleich zu L-PEG2000 eine um 700 % erhöhte Tumorakkumulation.

Nachweis kleiner allogener Brustkrebsherde (4T1 mit Tumorgröße 15 ~ 25 mm3) mit L-PEG2000-DBCO. (a,b) direkter Vergleich der Tumoraufnahme durch (a) L-PEG2000 und (b) L-PEG2000-DBCO; (c) zeitlicher Verlauf der Bioverteilung von L-PEG2000 und L-PEG2000-DBCO im Tumor über 120 Stunden und (d) zeitlicher Verlauf der Bioverteilung von L-PEG2000 und L-PEG2000-DBCO in der Leber über 120 Stunden.

Darüber hinaus führte eine zweite liposomale Verabreichung nach 96 Stunden nicht zu einer beschleunigten Blutclearance. Es wurde berichtet, dass die wiederholte Verabreichung von PEG-konjugierten Substanzen, einschließlich PEGylierter Liposomen, eine immunogene Reaktion hervorrufen kann, die zu einer erhöhten Clearance und verringerten Wirksamkeit von PEG-konjugierten Substanzen/PEGylierten Nanoträgern führt19,20,21.

Wir haben unsere Studien weiter auf andere Brustkrebs-Xenotransplantate ausgeweitet und die Fähigkeit von L-PEG2000-DBCO zum Nachweis von Brusttumor-Xenotransplantaten weiter bestätigt. Wie in Abb. 4 gezeigt, reichert sich L-PEG2000-DBCO in hoher Konzentration in MCF-7 (211 mm3), MDA-MB-231 (507 mm3) und MDA-MB-436 (232 mm3) Breact-Tumor-Xenotransplantaten an.

Optische Bildgebung von Brustkrebs-Xenotransplantaten mit L-PEG2000-DBCO: MCF-7 (211 mm3), MDA-MB-231 (507 mm3) und MDA-MB-436 (232 mm3).

Anschließend haben wir mit MDA-MB-231-Tumor-Xenotransplantat Leber- und Tumorgewebe aus den Mäusen herausgeschnitten und ex vivo optische Bildgebung und konfokale Mikroskopie durchgeführt. Die Ergebnisse stimmten auch mit den oben genannten Daten überein und bestätigten die Überlegenheit von L-PEG2000-DBCO gegenüber L-PEG2000. Wie in Abb. 5 gezeigt, übertraf L-PEG2000-DBCO L-PEG2000 im Tumor um mehr als das Dreifache und akkumulierte 40 % weniger in der Leber (Abb. 5b, c). Darüber hinaus zeigte die konfokale Mikroskopie auch eine höhere Tumoraufnahme und eine geringere Aufnahme von L-PEG2000-DBCO im Vergleich zu L-PEG2000 (Abb. 5d). Insgesamt stützen die In-vivo- und Ex-vivo-Ergebnisse nachdrücklich die hohe Leistung von L-PEG2000-DBCO bei der Akkumulation in hoher Konzentration in Tumorgeweben, was das immense Potenzial für die Nützlichkeit von L-PEG2000-DBCO als leistungsstarker Nanoträger verschiedener Moleküle unterstreicht Bildgebung und bildgeführte Anwendungen.

Optische Ex-vivo-Bildgebung und konfokale Mikroskopie mit L-PEG2000-DBCO und L-PEG2000 in Tumorgeweben und Leber eines MDA-MB-231-Tumor-Xenotransplantats: (a) Kontrollexperiment zum Nachweis der gleichen Fluoreszenzintensität von L-PEG2000 und L-PEG2000- DBCO, (b) optische Ex-vivo-Bildgebung mit L-PEG2000-DBCO und L-PEG2000 in Tumorgeweben und der Leber, (c) quantitative Aufnahme basierend auf der Fluoreszenzsignalintensität von L-PEG2000-DBCO und L-PEG2000 in Tumorgeweben und der Leber 24 Stunden nach der Liposomenverabreichung und (d) konfokale Mikroskopie-Bildgebung von L-PEG2000-DBCO und L-PEG2000 in Tumorgewebe und Leberschnitten.

Um unsere Ergebnisse zu vervollständigen und zu untermauern, haben wir den Nutzen von L-PEG2000-DBCO in vivo untersucht, um die bemerkenswerte Fähigkeit von L-PEG2000-DBCO bei der Visualisierung kleiner Tumoren zu demonstrieren. Tatsächlich war L-PEG2000-DBCO in der Lage, einen kleinen subkutanen Brusttumor (MDA-MB-231, Größe 10–20 mm3) zu erkennen, der sowohl mit bloßem Auge als auch im Hellfeld unsichtbar war, wie durch die Pfeile in Abb. 6a,b angezeigt . Es ist wichtig zu beachten, dass der kleine Tumor im Fettpolster implantiert ist und daher schwer vom Parakrebsgewebe zu isolieren war. Infolgedessen scheint die Tumorgröße in Abb. 6b größer zu sein als die genaue Größe des soliden Tumors, wie sie mit dem Messschieber gemessen wurde (Foto ist in Abbildung S4 dargestellt). Außerdem zeigt Abb. 6b, dass unser L-PEG2000-DBCO über eine hervorragende Targeting-Fähigkeit sowohl auf Krebsgewebe als auch auf Parakrebsgewebe verfügt, da das Signal von Parakrebsgewebe in Abb. 6b dargestellt ist. Darüber hinaus war L-PEG2000-DBCO L-PEG2000 bei Tumor-Xenotransplantaten mit größerer Größe überlegen, wie in Abb. 6b gezeigt. Die optische Ex-vivo-Bildgebung bestätigte auch die In-vivo-Daten, wie in Abb. 6c dargestellt.

(a) Die optische Bildgebung mit L-PEG2000-DBCO ermöglichte die Erkennung eines frühen Stadiums eines subkutanen Brusttumors (MDA-MB-231 mit einer Tumorgröße von 10 bis 20 mm3, 3 Tage nach der Implantation, sowohl für das bloße Auge als auch im Hellfeld unsichtbar, wie durch angezeigt Pfeile); (b) optische Ex-vivo-Bildgebung des Tumors und der Hauptorgane mit L-PEG2000-DBCO und (c) optische Bildgebung des MDA-MB-231-Tumor-Xenotransplantats mit L-PEG2000 im Vergleich zu L-PEG2000-DBCO.

Trotz erheblicher Arbeit an der Liposomentechnologie in den letzten Jahrzehnten sind Ansätze zur Optimierung der Oberflächenformulierung von Liposomen weitgehend unerforscht geblieben. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Oberflächenfunktionseinheiten eine Schlüsselrolle bei der zellulären Internalisierung und Tumoraufnahme spielen. Liposomale Oberflächen wurden in großem Umfang zur Konjugation von Arzneimitteln (dem sogenannten gezielten Liposom) für verschiedene therapeutische Anwendungen genutzt, wobei einige die DBCO-Einheit als Ort für die Arzneimittelkonjugation durch kupferfreie „Klick-Chemie“ nutzen22,23,24. Allerdings kann die Oberflächenkonjugation die Effizienz der liposomalen Zellinternalisierung und Tumoraufnahme verringern und somit die Wirksamkeit der Arzneimittelabgabe verringern. In dieser Studie haben wir herausgefunden, dass die Beschichtung der liposomalen Oberfläche mit der DBCO-Einheit (L-PEG2000-DBCO) zu einer bemerkenswert hohen Tumoraufnahme führen kann. Wir haben eine Reihe von In-vitro-, In-vivo- und Ex-vivo-Experimenten durchgeführt, um zu zeigen, dass L-PEG2000-DBCO herkömmlichem L-PEG2000 überlegen ist. Wir untersuchten zunächst die liposomale Aufnahme in normalen Zellen und Brustkrebszellen in vitro mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie. Die Durchflusszytometrie zeigte eine höhere L-PEG2000-DBCO-Aufnahme im Vergleich zu L-PEG2000, ein Befund, der durch konfokale Mikroskopie weiter bestätigt wurde (Abb. 2). Da die optische Bildgebung effektiv zur Überwachung des liposomalen Transports in vitro und in vivo über den in der liposomalen Lipiddoppelschicht eingekapselten Fluoreszenzfarbstoff eingesetzt werden kann, nutzten wir die optische Bildgebung, um die Bioverteilung von L-PEG2000-DBCO in vivo in verschiedenen Brustkrebsmodellen zu verfolgen. In einem Kontrollexperiment zeigten Liposomenlösungen mit gleichen Volumina von L-PEG2000 und L-PEG2000-DBCO eine ähnliche Fluoreszenzintensität (Abb. 5a und Abbildung S2), was die Verwendung der Fluoreszenzintensität als Maß zur Quantifizierung der liposomalen Bioverteilung in vitro und in vivo rechtfertigt und ex vivo. Die Untersuchung von Brusttumoren (Abb. 3, 4, 5, 6) zeigte, dass L-PEG2000-DBCO in vivo bevorzugt von Tumorgeweben aufgenommen wurde und die Aufnahme in Leber und Milz im Vergleich zu L-PEG2000 verringert war. Beispielsweise zeigten die mit MDA-MB-231-Tumor-Xenotransplantat erhaltenen In-vivo-Daten, dass die Tumorsignalintensität von L-PEG2000-DBCO und L-PEG2000 12,2 × 1010 und 3,9 × 1010 p/s/sr/mW betrug (Abb . 5c), was einem Anstieg der L-PEG2000-DBCO-Tumorakkumulation um 213 % im Vergleich zu L-PEG2000 entspricht. Im Gegensatz dazu betrug die Lebersignalintensität von L-PEG2000 und L-PEG2000-DBCO 11,2 × 1010 bzw. 6,3 × 1010 p/s/sr/mW, was einer relativen Verringerung der Leberaufnahme von L-PEG2000-DBCO um 46 % entspricht zu L-PEG2000. Darüber hinaus bestätigten durch konfokale Mikroskopie abgebildete Tumor- und Lebergewebeschnitte die optische In-vivo- und Ex-vivo-Bildgebung (Abb. 5d).

Wir erwarten, dass unsere Erkenntnisse bei der effizienten Bereitstellung molekularer Bildgebungsverbindungen, bildgesteuerter Sonden und Krebstherapeutika Anwendung finden. Ein Vorteil ist die Fähigkeit von L-PEG2000-DBCO, kleine Tumoren wie ein kleines orthotopisches 4T1-Implantat sichtbar zu machen (Abb. 2). L-PEG2000-DBCO konnte einen kleinen subkutanen Brusttumor (MDA-MB-231, Größe 10 ~ 20 mm3) erkennen, der sowohl mit bloßem Auge als auch im Hellfeld unsichtbar war, wie durch die Pfeile in Abb. 6 angezeigt. Zusammengenommen , die Daten in Abb. 3 und 6 zeigen, dass L-PEG2000-DBCO die Fähigkeit gezeigt hat, den kleinen Tumor sowohl in allogenen (4T1) als auch xenogenen (MDA-MB-231) Transplantationsmodellen sichtbar zu machen. Darüber hinaus war L-PEG2000-DBCO in der Lage, einen kleinen Tumor (10 ~ 15 mm3) und den angrenzenden Haupttumor MDA-MB-231 (196 ~ 255 mm3) zu erkennen, sichtbar zu machen und zwischen diesen zu unterscheiden und sich in dem kleinen Tumor anzusammeln gleiche Signaldichte wie der große Tumor (Abbildung S3). Daher verfolgen wir derzeit den Nutzen von L-PEG2000-DBCO für die molekulare Bildgebung und bildgesteuerte Chirurgie.

Der Mechanismus, der die hohe Tumoraufnahme von L-PEG2000-DBCO vorantreibt, und wie dies durch die DBCO-Einheit erleichtert wird, ist nicht vollständig geklärt. Beispielsweise führt die Konjugation von L-PEG2000-DBCO mit DV1-N3-Peptiden zu einer verminderten Tumoraufnahme, ähnlich wie bei L-PEG2000, was die Schlüsselrolle der DBCO-Einheit bei der Förderung einer hohen Tumoraufnahme unterstreicht12. Es ist wahrscheinlich, dass der EPR-Effekt (Enhanced Permeability and Retention) zu einer verbesserten Tumoraufnahme beiträgt. Lange Zirkulationszeiten ermöglichen es dem Liposom, durch durchlässige Tumorgefäße bevorzugt in das Tumorgewebe einzudringen und durch beeinträchtigte Lymphdrainage im Tumorbett zu verbleiben25. Es wurde jedoch berichtet, dass der EPR-Effekt allein zu einer weniger als zweifachen Steigerung der Nano-Wirkstoffverabreichung führt25,26. Weitere Studien zu DBCO-markierten Liposomen werden erforderlich sein, um den Mechanismus der hohen Akkumulation von L-PEG2000-DBCO in Tumorgeweben und der geringen Akkumulation in Nichtzielgeweben aufzuklären, die normalerweise therapeutische Toxizität vermitteln. Verbesserte chemische Modifikationen von DBCO-markierten Liposomen können zu verbesserten Formulierungen mit verbesserter Tumorspezifität führen. Diese Studien laufen in unserem Labor und werden in zukünftigen Veröffentlichungen veröffentlicht.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Liposomenoberfläche die Zellaufnahme in vitro und das Eindringen in Tumorgewebe in vivo erheblich beeinflussen und gleichzeitig das Eindringen in Gewebe außerhalb des Ziels minimieren kann. Wir sind optimistisch, dass unsere Erkenntnisse den Weg für die Entwicklung von Liposomen der nächsten Generation für die effiziente Bereitstellung molekularer Bildgebung und bildgesteuerter Sonden sowie von Krebstherapeutika ebnen werden.

Wir haben eine Reihe von In-vitro- und In-vivo-Experimenten durchgeführt, um zu zeigen, dass die liposomale Oberflächenmodifikation eine Schlüsselrolle bei der Induktion einer hohen zellulären Internalisierung in vitro und einer hohen liposomalen Akkumulation in Krebsgeweben in vivo spielen kann. Insbesondere haben wir herausgefunden, dass eine weiche DBCO-Schicht einen bemerkenswerten Anstieg der Tumoraufnahme von L-PEG2000-DBCO im Vergleich zu L-PEG2000 induziert, obwohl beide liposomalen Formulierungen ein identisches Grundgerüst haben. Wir haben die erhöhte Fähigkeit von L-PEG2000-DBCO gezeigt, sich unabhängig von Tumorgröße, -typ, -position, -rezeptorexpression und dem Zustand der Wirtsmäuse in Brustkrebsherden anzureichern. Bemerkenswerterweise wurde im Vergleich zu L-PEG2000 auch eine signifikante Verringerung der L-PEG2000-DBCO-Aufnahme in der Leber und außerhalb des Zielgewebes beobachtet. Insgesamt werden unsere Erkenntnisse den Weg für die Entwicklung neuer liposomaler Formulierungen mit verbesserter Internalisierung durch Tumorgewebe ebnen. Wir untersuchen derzeit den Nutzen von L-PEG2000-DBCO als wirksamen Träger für molekulare Bildgebung und bildgeführte Sonden.

1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[dibenzocyclooctyl(polyethylenglykol)-2000] (Ammoniumsalz) (DSPE-PEG2000-DBCO), 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin -N-[Methoxy(polyethylenglykol)-2000] (Ammoniumsalz) (DSPE-PEG2000) und 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) wurden von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) bezogen. 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyaninperchlorat (DiI) wurde von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) gekauft. Cy5-Amin (nicht sulfoniert) wurde von APExBIO Technology LLC (Houston, Texas) gekauft. (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindotricarbocyaniniodid) (DiR) wurde von Biotium™ (Fremont, CA) gekauft. Zertifiziertes fetales Rinderserum (FBS) wurde von Gibco® von Life Technologies Corporation (Grand Island, NY) bezogen. Die mit Kernporen geätzte Membran (Porengröße: 100 nm, 200 nm) wurde von Whatman (Florham Park, NJ) bezogen.

Mit PEG2000-DBCO modifizierte Liposome (L-PEG2000-DBCO) und mit PEG2000 (L-PEG) beschichtete Liposome wurden mit der Extrusionsmethode hergestellt15. Kurz gesagt, eine Mischung aus DOPC: DSPE-PEG2000-DBCO: DiR-Farbstoff (97:2:1, mol:mol:mol) oder DOPC: DSPE-PEG2000: DiR-Farbstoff (97:2:1, mol:mol:mol) wurden in Chloroform gelöst und in einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck getrocknet. Bemerkenswert ist, dass der DiR-Farbstoff entsprechend dem gewünschten experimentellen Design auf DiI und Cy5-Amin umgestellt werden kann. Der Lipidfilm wurde in 5 ml entionisiertem Wasser (pH 7,0) unter leichtem Schütteln hydratisiert, um eine 2,6 mM Lipidlösung zu ergeben. Die Lipidlösung durchlief 10 Gefrier-Tau-Zyklen, um multilamellare Liposomen zu bilden. Liposomen wurden nacheinander über einen Northern Lipids Extruder mit 200 nm und 100 nm großen nanoporösen Polycarbonatmembranen extrudiert. Nach der Extrusion wurde die Liposomenlösung in Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) unter Verwendung einer Slide-A-Lyzer-Dialysekassette (MWCO 100 kDa) über Nacht bei Raumtemperatur (RT) dialysiert.

Dynamische Lichtstreuung (DLS) wurde verwendet, um die Integrität, Größe und das Zeta-Potenzial der Vesikel während und nach der Kopplungsreaktion zu überwachen.

Liposomen (1 ml, 2,6 μM Lipide) wurden 1 Minute lang mit 1 % OsO4 in 0,1 M PBS in einem Eisbad gefärbt. Die Lösung wurde durch eine 100 nm dicke Membran mit geätzten Kernporen filtriert. Der Film wurde bei jedem Schritt 15 Minuten lang in einer abgestuften Reihe von Ethanol (50 %–75 %–100 %–100 %) dehydriert. Der Film wurde durch Critical Point Drying gemäß den Anweisungen des Herstellers getrocknet. Der Film wurde mit leitfähigem Klebeband auf die Oberseite der Stahlscheibe geklebt, mit Gold besputtert und für die REM-Detektion verwendet.

Alle Zelllinien wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) bezogen. Die nicht-neoplastische Nierenepithelzelle von Cercopithecus aethiops – normale Nierenzelllinie (Vero), humane primäre Her2/neu+-Brustkrebszelllinie (MCF-7), humane dreifach negative Brustkrebszelllinien (MDA-MB-NT17631 und MDA- MB-436) und die Maus-Brustepithelkarzinomzelllinie (4T1) wurden in unseren aktuellen Studien verwendet. Alle Krebszelllinien wurden in DMEM mit 10 % FBS und 100 Einheiten Penicillin-Streptomycin kultiviert. Alle Zellen wurden in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C gehalten.

Für die mittels Durchflusszytometrie analysierte Liposomenbindung wurden Vero, MCF-7, MDA-MB-231 und MDA-MB-436 (2 × 106) 2–5 Tage lang in einen 75-cm2-Kolben ausgesät. Nach Erreichen einer Konfluenz von 50 % wurden die Zellen mit 0,25 % Trypsin/0,1 % EDTA abgelöst und anschließend zweimal mit PBS gewaschen. Nach 30-minütiger Blockierung mit BSA (1 %) wurden die Proben 2 Stunden lang bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 (0,15 mM Lipide pro 106 Zellen) mit Liposomen mit DiI-Farbstoff gefärbt. Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurden die Proben in 500 μl PBS resuspendiert und mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung eines BD LSR II-Analysegeräts (B&D Bioscience, CA) ausgewertet.

Die Liposomalaufnahme in Zellen wurde durch konfokale Mikroskopie analysiert. MDA-MB-231-Zellen (2 × 105) wurden in einem Lab-Tek II Chamber Slide System separat mit 2 ml Medium über Nacht bei 37 °C ausgesät. Die Proben wurden mit Liposomen mit DiI-Farbstoff 2 Stunden lang bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 (0,15 mM Lipide pro 106 Zellen) gefärbt. Nachdem das Medium entfernt worden war, wurden die Zellen zweimal mit PBS gespült und mit 4 % Formaldehyd in PBS bei RT für 10 Minuten fixiert. Zur Färbung des Zellkerns wurde DAPI verwendet und anschließend dreimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden unter einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop LSM 710 (Zeiss) untersucht. Digitale Bilder wurden mit der Software Image J (NIH) aufgenommen und verarbeitet.

Alle Tierversuche wurden vom Stony Brook University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) bewertet und genehmigt. Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des genehmigten IACUC-Protokolls und gemäß den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt.

24 weibliche NOD.Cg-Prkdcscid/J-Mäuse (SCID-Mäuse) und 12 weibliche Babl/C-Mäuse wurden beim Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) bestellt. Für das allogene Transplantationsmodell wurden die 4T1-Zellen aus drei Platten geerntet und mit PBS gewaschen. Dann wurden 20 k Zellen pro Maus an Zellsuspensionen mit einem kleinen Einschnitt in das zweite (von unten gezählte) Brustfettstück injiziert, um an der Injektionsstelle einen einzelnen Tumorknoten zu bilden. Nach 3 Tagen Wachstum implantierten sich die 4T1-Zellen in das Brustfettpolster und bildeten einen 15–25 mm3 großen soliden Tumor. Anschließend wurden die Mäuse in zwei Gruppen eingeteilt: die L-PEG2000-Gruppe und die L-PEG2000-DBCO-Gruppe, denen jeweils die liposomale Formulierung per IV-Injektion verabreicht wurde. Die Tumorsignalintensität, das Körpergewicht und der Lebenszustand der Mäuse wurden zu bestimmten Zeitpunkten nach der Liposomenverabreichung aufgezeichnet. Der zweite Injektionszyklus wurde 96 Stunden nach der ersten Liposomenverabreichung verabreicht.

Für xenogene Transplantationsmodelle wurden die MCF-7-, MDA-MB-231- und MDA-MB-436-Zellen aus 12 Platten geerntet und mit PBS gewaschen. Dann wurden 50 k Zellen pro Maus an Zellsuspensionen subkutan in die rechte Schulter injiziert, um die xenogenen Brustkrebsmodelle zu konstruieren. Die Tumorgröße erreichte etwa 100 mm3 nach 7–10 Tagen für MDA-MB-231, 15–20 Tagen für MDA-MB-36 bzw. 25–30 Tagen für MCF-7. Dann wurde den verschiedenen Gruppen von Brustkrebsmodellen das gleiche Volumen an L-PEG2000 oder L-PEG2000-DBCO injiziert.

In-vivo- und Ex-vivo-Bildgebung wurde mit dem IVIS Lumina III-System (Perkin Elmer) durchgeführt. Kurz gesagt, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenzintensität auf dem gleichen Niveau bleibt, wurden 3 × 100 μl der L-PEG2000- und L-PEG2000-DBCO-Lösungen getrennt in 96-Well-Platten gegeben, bevor sie verabreicht und unter DiR-Nahinfrarot gescannt wurden, wobei die folgenden Parameter verwendet wurden: Anregungsfilter 740 nm, Emissionsfilter 790 nm, Binning 4 oder 8, f/Stop 2. Diesen Mäusen, denen die verschiedenen Liposomen verabreicht wurden, wurden dreimal unter Narkose (2 % Isofluran über den Verdampfer des IVIS-Instruments) nicht-invasiv gescannt. Nach der In-vivo-Analyse wurden die Mäuse sofort getötet. Die Organe (Tumor, Leber, Herz, Lunge, Milz, Gehirn, Niere, Dünndarm und Dickdarm) wurden gesammelt und Bilder wurden unter Verwendung derselben Parameter wie oben beschrieben aufgenommen. Die gesammelten Bilder wurden mit der Software Living Image 4.3.1 (Perkin Elmer) analysiert: ROIs wurden entworfen, um jedes Organ angemessen auszuwählen und die Strahlungseffizienz zu berechnen.

Den tumortragenden Mäusen wurden die Liposomen L-PEG2000 und L-PEG2000-DBCO mit 2 % DiI-Komponenten injiziert. Nach 24-stündiger Liposomenverabreichung werden die Tumore und Lebern geerntet und in einem Kühlschrank bei –80 °C eingefroren. Die gefrorenen Proben wurden mit einem Kryostat (CM3050 S, Leica, Deutschland) weiter in Abschnitte (10 μm) geschnitten. Die Schnitte wurden mit DAPI gefärbt, anschließend mit Montageöl versiegelt und anschließend mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Zeiss, LSM 710) beobachtet.

Alle quantitativen Experimente wurden dreifach durchgeführt und die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt, sofern nicht anders angegeben. Die statistische Analyse der Daten erfolgte mittels Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukey-Posttest. Unterschiede zwischen Gruppen auf einem Niveau von p < 0,05 wurden als statistisch signifikant (*dargestellt) und solche bei p < 0,01 als hochsignifikant (**dargestellt) angesehen.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel [und seinen ergänzenden Informationsdateien] enthalten.

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Die Autoren möchten dem Stony Brook Cancer Center für die Startunterstützung des Turkman Lab danken. Darüber hinaus wurde die in dieser Veröffentlichung beschriebene Forschung teilweise vom Lynn November Charitable Fund (Turkman) unterstützt.

Stony Brook Cancer Center, Stony Brook, Long Island, USA

Daxing Liu, Jules Cohen & Nashaat Turkman

Abteilung für Radiologie und Krebszentrum, Renaissance School of Medicine, Stony Brook University, 100 Nicolls Road, Stony Brook, NY, 11794, USA

Daxing Liu & Nashaat Turkman

Abteilung für Hämatologie/Onkologie, Abteilung für Medizin, School of Medicine, Stony Brook University, Long Island, NY, USA

Jules Cohen

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Alle Autoren überprüften das Manuskript und trugen zum Studiendesign, zur Datenanalyse und zum Verfassen des Manuskripts bei. DL führte die Experimente durch.

Korrespondenz mit Nashaat Turkman.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Liu, D., Cohen, J. & Turkman, N. PEG2000-DBCO-Oberflächenbeschichtung erhöht die intrazelluläre Aufnahme von Liposomen durch Brustkrebs-Xenotransplantate. Sci Rep 12, 10564 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14947-8

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Eingegangen: 3. April 2022

Angenommen: 15. Juni 2022

Veröffentlicht: 22. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14947-8

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