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May 07, 2023

Struktur und Mechanismus des Alkans

Band Nature Communications

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 2180 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Alkane sind die energiereichste Form von Kohlenstoff und weit verbreitet in der Umwelt. Ihre Umwandlung durch Mikroben stellt einen entscheidenden Schritt im globalen Kohlenstoffkreislauf dar. Alkanmonooxygenase (AlkB), ein membrandurchspannendes Metalloenzym, wandelt im ersten Schritt des mikrobiell vermittelten Abbaus von Alkanen geradkettige Alkane in Alkohole um und spielt damit eine entscheidende Rolle im globalen Kohlenstoffkreislauf und der biologischen Sanierung von Öl. Die Artenvielfalt von AlkB wird auf seine Fähigkeit zurückgeführt, Alkane unterschiedlicher Kettenlänge zu oxidieren, während einzelne AlkBs auf einen relativ engen Bereich abzielen. Mechanismen der Substratselektivität und der katalytischen Aktivität sind weiterhin unklar. Hier berichten wir über die Kryo-EM-Struktur von AlkB, die eine besondere Architektur für Membranenzyme bietet. Unsere Struktur- und Funktionsstudien offenbaren eine unerwartete Konfiguration des Dieisenzentrums und identifizieren molekulare Determinanten für die Substratselektivität. Diese Ergebnisse geben Einblick in den katalytischen Mechanismus von AlkB und geben Aufschluss über seine Funktion in alkanabbauenden Mikroorganismen.

Kohlenwasserstoffe sind allgegenwärtig. Bis zu 800 Millionen Tonnen werden jedes Jahr durch eine Kombination aus natürlichen Sickerstellen, unbeabsichtigten Freisetzungen aus der Erdölindustrie und der biologischen Aktivität von Cyanobakterien freigesetzt1,2,3. Diese Moleküle sind eine reichhaltige Nahrungsquelle für Kohlenwasserstoff metabolisierende Bakterien und haben große Auswirkungen auf Ökosysteme4,5. Ein unverzichtbarer Schritt im Kohlenstoffkreislauf ist demnach die enzymatische Umwandlung flüssiger Alkane, um sie biologisch nutzbar zu machen.

Bakterien, die flüssige Alkane verstoffwechseln können, kommen weltweit vor, von der Äquatorregion6,7 über ölbelastete Golfe8 bis hin zu kohlenwasserstoffreichen, unberührten Böden in der Arktis und Antarktis7,9,10,11,12,13,14,15,16, 17,18,19,20,21,22. In diesen Umgebungen ist die Alkanmonooxygenase (AlkB) das primäre Enzym, das die Oxidation flüssiger Alkane katalysiert. AlkB oxidiert eine Reihe geradkettiger Alkane und ist in verschiedenen Bakterien weit verbreitet, die Alkane als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle nutzen10,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35,36,37. Tatsächlich war es das am unterschiedlichsten exprimierte Gen in der mikrobiellen Gemeinschaft, das nach der Ölkatastrophe auf der Deepwater Horizon schnell wuchs38.

AlkB gehört zur Membran-Fettsäure-Desaturase (FADS)-ähnlichen Superfamilie, die eine Gruppe von Nicht-Häm-Dieisenmonooxygenasen darstellt, die aliphatische Fettacylketten desaturieren oder hydroxylieren39. AlkB spiegelt die katalytische Plastizität der Membran-FADS-ähnlichen Superfamilie wider und hydroxyliert selektiv die terminale Methylgruppe von geradkettigen Alkanen; andere Mitglieder der Familie führen jeweils entweder Doppelbindungen oder Hydroxylgruppen in lipidbasierte Substrate ein. Den ersten Einblick in die Struktur dieser einzigartigen Biokatalysatoren lieferten die Strukturen der Stearoyl-CoA-Desaturase SCD1 von Säugetieren und der Hefe-Sphingolipid-α-Hydroxylase Scs7p40,41,42,43. Abgesehen von den charakteristischen histidinreichen Motiven weist AlkB keine signifikanten Sequenzähnlichkeiten oder Elektronentransferpartner mit diesen beiden Fettsäureenzymfamilien auf. Die genaue Konfiguration des Dieisenzentrums von AlkB bleibt unklar. Funktionelle AlkBs wurden auch in pathogenen Gattungen wie Mycobacterium tuberculosis H37RV, Legionella pneumophilia Stamm Philadelphia und Pseudomonas aeruginosa PAO131,36,44 identifiziert, was darauf hindeutet, dass AlkB das Wachstum von Krankheitserregern fördern könnte36. Mehr als 20.000 AlkB-Proteinsequenzen wurden identifiziert, was seine weite Verbreitung unter Mikroorganismen widerspiegelt.

Trotz seiner grundlegenden Bedeutung für den globalen Kohlenstoffkreislauf und die menschliche Gesundheit bleibt der katalytische Mechanismus von AlkB rätselhaft und die Struktur des Enzyms muss noch experimentell bestimmt werden. Zentrale mechanistische Fragen bleiben unbeantwortet: Welche Merkmale unterscheiden AlkB von den Fettsäureenzymen und ermöglichen es ihm, die terminale Methylgruppe linearer Alkane selektiv zu hydroxylieren? Welche Merkmale unterscheiden ein AlkB vom anderen, was wiederum der gesamten Familie das bemerkenswert breite Substratspektrum verleiht, das sie zu einem Eckpfeiler im globalen Kohlenstoffkreislauf macht? Der Mangel an Informationen hat eine erhebliche Lücke in unserem Verständnis darüber hinterlassen, wie die Struktur von AlkB seine Funktion erleichtert, und seine Anwendung in der Biotechnologie erheblich behindert.

AlkB ist eines von relativ wenigen Enzymen, deren etablierte Funktion darin besteht, Alkane unter Umgebungsbedingungen in Alkohole umzuwandeln (Abb. 1a). Dies ist eine chemisch schwierige Reaktion aufgrund der unpolaren Natur der CH-Bindung und ihrer großen Dissoziationsenergie sowie der Herausforderungen, die mit der selektiven Aktivierung von O2 verbunden sind. Zu den anderen Alkan-oxidierenden Enzymen gehören partikuläre kupferhaltige Methanmonooxygenasen (pMMO), Häm-haltige Cytochrom-P450-Enzyme, zwei Flavin-abhängige Enzyme LadA und AlmA45 sowie ein weiteres Nicht-Häm-Dieisenenzym, die lösliche Methanmonooxygenase (sMMO). AlkB ist unter alkanoxidierenden Enzymen einzigartig, da es über eine stickstoffreiche Ligandenumgebung rund um das Metallzentrum verfügt; Die anderen Nicht-Häm-Dieisenenzyme haben carboxylatreiche Eisenzentren. Dies legt nahe, dass AlkB über einen ausgeprägten katalytischen Mechanismus verfügt. Da jahrzehntelange funktionelle Studien keinen Erfolg bei der Definition dieses Mechanismus hatten, versuchten wir, strukturelle Einblicke in sein aktives Zentrum zu gewinnen.

a Schlüsselschritte beim biologischen Abbau von Alkanen. AlkBs initiieren den Alkanstoffwechsel, indem sie Alkane in Alkohole umwandeln. b Alkanhydroxylierungsaktivität von FtAlkB auf Oktan. Ein repräsentatives GC-MS-Profil des Octanol-Peaks von FtAlkB (schwarz) und der Negativkontrolle ohne FtAlkB (rot). Die Experimente wurden dreimal unabhängig voneinander wiederholt und es wurden ähnliche Ergebnisse beobachtet. Die Aktivität des gereinigten Proteins entspricht 225 Umsatzzahlen oder 5 μmol Produkt pro mg Protein. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. c Eisenbelegung von FtAlkB bestimmt durch ICP-MS (NC, Negativkontrolle; Mittelwert ± SEM; n = 3 unabhängige Experimente). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. d Kryo-EM-Dichtekarte des FtAlkB-Nanokörperkomplexes. e Gesamtstruktur von FtAlkB, parallel zur Membran betrachtet. Zwei Eisenatome sind als Olivenkugeln dargestellt.

Hier berichten wir über eine Kryo-EM-Struktur von AlkB und begleitende Charakterisierungen seiner katalytischen Aktivitäten. Unsere Studie enthüllt die Architektur dieser Enzymfamilie, Schlüsselmerkmale des Dieisenzentrums und molekulare Determinanten der Substratselektivität, die dazu beitragen, mehr als 50 Jahre an Daten zu diesem wichtigen, aber schwer fassbaren Treiber des globalen Kohlenstoffkreislaufs in Einklang zu bringen.

Um Strukturstudien zu AlkB zu erleichtern, haben wir das biochemische Verhalten einer großen Gruppe von AlkB-Homologen systematisch charakterisiert. Fontimonas thermophila AlkB (FtAlkB), das eine Sequenzidentität von 62 % mit dem Prototyp Pseudomonas oleovorans AlkB (GPo1AlkB, ergänzende Abbildung 1) aufweist, erwies sich hinsichtlich der Proteinausbeute und -stabilität als vielversprechend (ergänzende Abbildung 2a). FtAlkB zeigte robuste Alkanhydroxylase-Aktivitäten an einem Modell-Alkanoktan (5 μmol Produkt/mg Protein), was im Vergleich zum aktivsten AlkB, das wir zuvor charakterisiert hatten (4,5 μmol Produkt/mg Protein für Alcanivorax borkumensis AlkB46), günstig ist (Abb. 1b). Diese Eigenschaften machten FtAlkB zu einem hervorragenden Kandidaten für strukturelle und mechanistische Studien.

Da die katalytische Aktivität von AlkB von Eisen abhängt, haben wir den Eisengehalt von FtAlkB mithilfe der Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) gemessen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass das gereinigte FtAlkB mit Eisen beladen ist, während wir in einem Kontrollprotein kein Eisen über dem Hintergrund nachweisen konnten. Darüber hinaus konnten wir kein Zink über dem Hintergrundwert nachweisen (Abb. 1c). Diese Ergebnisse zeigen, dass FtAlkB Eisen spezifisch bindet. Der spezifische Eisengehalt beträgt ungefähr zwei Eisenionen pro Proteinmolekül, was mit den Strukturbeobachtungen übereinstimmt, die wir unten präsentieren.

Um Einblicke in die molekularen Mechanismen der AlkB-katalysierten Reaktion zu gewinnen, führten wir Einzelpartikel-Kryo-EM-Studien an FtAlkB durch, das im Detergens n-Dodecyl-β-d-Maltopyranosid (DDM, ergänzende Abbildung 3 und ergänzende Tabelle 1) gereinigt wurde ). Um die relativ geringe Größe des Proteins (45 kD) zu überwinden und die Partikelausrichtung zu erleichtern, haben wir einen Nanokörper entwickelt, der spezifisch an FtAlkB bindet und einen stabilen Komplex bildet (ergänzende Abbildung 2b). Mit Hilfe eines Nanokörpers als Referenzmarker erhielten wir 3D-Rekonstruktionen von FtAlkB mit einer Auflösung von 3,45 Å (mit einer Maske nur auf FtAlkB; 3,59 Å mit einer Maske auf FtAlkB-Nanokörper), und die lokale Auflösung von FtAlkB erreicht 2,8 Å bis 3,2 Å. Die hochwertige Karte von FtAlkB ermöglichte es uns, das Protein eindeutig zu verfolgen und ein Modell zu erstellen (Abb. 1d, e und ergänzende Abb. 4a).

Die FtAlkB-Struktur besteht aus einer Transmembrandomäne (TMD) und einer katalytischen Domäne. Die „Positive-Inside“-Regel47 sagt voraus, dass sich sowohl der N- als auch der C-Terminus von FtAlkB auf der intrazellulären Seite der Membran befinden sollten, wodurch die katalytische Domäne intrazellulär platziert wird. Dies steht im Einklang mit der intrazellulären Lage der Redoxpartner, die vermutlich in der Nähe der katalytischen Domäne interagieren. Im TMD sind sechs TMs in einer zeltartigen Form angeordnet, wobei ihre zytosolischen Enden voneinander entfernt sind, wodurch eine große Schnittstelle zur Aufnahme der katalytischen Domäne entsteht (Abb. 1e). Darüber hinaus bilden die H2- und H3-Helices eine Wiedereintrittsschleife, die zur Hälfte in die Membran eingeführt wird. An der Membran-Zytosol-Grenzfläche helfen drei Helices parallel zur Membranoberfläche, die zytosolische Domäne auf der Membran zu verankern und die Strukturelemente so zu positionieren, dass sie die Bildung des aktiven Zentrums unterstützen. Die zytoplasmatischen Enden von TM4 und TM6 ragen aus der Membran heraus und stellen zwei histidinreiche Motive bereit, die die beiden Eisenionen koordinieren. Die Dieisenstelle ist außerdem von zwei zytoplasmatischen Segmenten umgeben, in denen sich die beiden anderen histidinreichen Motive befinden: eine Helix-Turn-Helix zwischen TM4 und TM5 und ein langer C-Terminus mit kurzen α-Helices (ergänzende Abbildung 4g).

Basierend auf einer Suche in der Proteindatenbank mit dem Dali-Server48 weist FtAlkB keine signifikante strukturelle Ähnlichkeit mit anderen Proteinen mit experimentellen Strukturen auf. AlkB stellt eine Faltung dar, die sich erheblich von anderen bekannten Proteinfamilien unterscheidet, einschließlich derjenigen der FADS-ähnlichen Superfamilie wie Fettsäuredesaturase SCD1 und Sphingolipid-α-Hydroxylase Scs7p (ergänzende Abbildung 4e – g).

In FtAlkB werden zwei Eisenionen durch neun Histidinreste aus vier konservierten histidinreichen Motiven koordiniert (Abb. 2a und ergänzende Abb. 1). Ein Eisen wird durch fünf Imidazolringe koordiniert, während das andere durch vier gebunden ist (ergänzende Abbildung 4b). Diese Histidinreste sind speziesübergreifend invariant und erwiesen sich als unverzichtbar für die enzymatischen Funktionen in GPo1AlkB39,49. Die Koordinationsgeometrie beider Eisen weist einige Merkmale einer oktaedrischen Anordnung auf, wobei das andere Eisen entlang der Achse erscheint, an der ein Ligand fehlt; Dadurch bleiben die beiden Eisenionen um etwa 5,4 Å voneinander entfernt. Unsere Struktur zeigt direkt eine stickstoffreiche Umgebung des Dieisenzentrums in AlkB. Dies bestätigt die Identität der Metallliganden, die aus früheren spektroskopischen Untersuchungen von AlkB50 vermutet wurde, und steht in scharfem Kontrast zu der sauerstoffreichen Koordination, die in anderen bekannten Nicht-Häm-Dieisenalkan-Monooxygenasen gefunden wird. Wir beobachteten auch grundlegende Unterschiede in der Konfiguration der Dieisenzentren zwischen AlkB und anderen Dieisenalkanmonooxygenasen wie sMMO. Erstens ist der Abstand zwischen den beiden Ionen in FtAlkB mit ~5,4 Å länger als der Eisen-Eisen-Abstand von 3 Å in sMMO. Zweitens wird für FtAlkB kein Brückenligand beobachtet, wohingegen sMMO Carboxylat- und Hydroxidgruppen aufweist, die zwei Eisenionen verbrücken. Diese wesentlichen Unterschiede deuten darauf hin, dass AlkB möglicherweise einen bisher unbekannten Mechanismus zur Alkanoxygenierung nutzt.

a Struktur von FtAlkB mit einer Nahaufnahme der Dieisen-Koordination. Die koordinierenden Histidinreste und ein umgebendes Glutamat sind in Stäbchen dargestellt. b Ausrichtungen konservierter Histidinmotive. c Überlagerung von Dieisenzentren in den Mitgliedern der FADS-ähnlichen Superfamilie.

Diese Dimetallkonfiguration von AlkB wird durch Beobachtungen bei anderen Lipid-metabolisierenden Proteinen in der FADS-ähnlichen Superfamilie gestützt, einschließlich Fettsäure-Desaturasen und Sphingolipid-α-Hydroxylasen. Obwohl AlkB nur eine begrenzte Gesamtsequenz und strukturelle Ähnlichkeit mit ihnen aufweist, sind die charakteristischen histidinreichen Motive von AlkB im Raum ähnlich organisiert, und Eisen-koordinierende Histidinreste bilden eine Dieisen-Bindungsstelle, die denen in Fettsäuredesaturasen und Sphingolipid-α-hydroxylasen ähnelt (Abb. 2b, c). Der unterschiedliche Abstand zwischen Histidinresten wird durch unterschiedliche helikale Konformationen ausgeglichen. Diese Beobachtungen lassen auf einen gewissen gemeinsamen Katalysemechanismus zwischen diesen stickstoffreichen Dieisenzentren schließen.

Dennoch gibt es wichtige Unterschiede: Es gibt eine Carboxylgruppe eines konservierten Glutamatrests, E281, in AlkB, der sich in der Nähe von Fe1 befindet (dem von vier Histidinresten koordinierten Eisen), die möglicherweise mit diesem Eisen und benachbarten Histidinresten interagieren könnte, obwohl die Seite Die Kette von E281 ist in der Kryo-EM-Karte nicht ausreichend aufgelöst. Im Gegensatz dazu nimmt ein Wassermolekül in SCD1 eine ähnliche Position ein, während Scs7p über ein zusätzliches Histidin verfügt, das für beide Eisen eine Fünf-Histidin-Koordination bildet (Abb. 2c). Diese Unterschiede in der Umgebung des Eisens können sich auf die Reaktivität des Eisens und die Stabilität der Reaktionszwischenprodukte auswirken, was möglicherweise eine Rolle bei den unterschiedlichen Reaktionen spielt, die von diesen Enzymen katalysiert werden.

Das Verständnis, wie inerte hydrophobe Substrate das aktive Zentrum von AlkB erreichen, ist entscheidend für die Aufklärung seiner Fähigkeit zur Kohlenwasserstoffverarbeitung. TM2, TM4 und TM6 bilden ein längliches Vestibulum, das sich von der TM-Domäne in die katalytische Domäne erstreckt und bis knapp über das aktive Zentrum reicht. Das Vestibül ist größtenteils mit hydrophoben Resten ausgekleidet und der Durchmesser des Vestibüls ist mit der Alkanbindung kompatibel (Abb. 3a). Interessanterweise fanden wir eine längliche röhrenförmige Nichtproteindichte im Vestibül (Abb. 3b und ergänzende Abb. 4c). Ein Ende der röhrenförmigen Dichte befindet sich in der Nähe des aktiven Zentrums und das distale Ende befindet sich in der Nähe von W62. Die Form der Dichte ist mit einer Acylkette kompatibel, und die umgebenden hydrophoben Reste könnten zur Aufnahme eines Alkans beitragen. Basierend auf der Längenübereinstimmung haben wir vorläufig Dodecan in die Dichte eingeordnet, obwohl die molekulare Identität der Dichte bei dieser Auflösung nicht eindeutig geklärt werden kann. Das Ende des Alkans befindet sich in einem ähnlichen Abstand zu den beiden Eisenatomen (~ 5,1 Å bzw. ~ 5,7 Å; ergänzende Abbildung 4d).

a Eine Schnittansicht des Substratkanals von FtAlkB. Zwei Eisenatome sind als Olivenkugeln dargestellt. b Eine Nahaufnahme der mit Dodecan angepassten Ligandendichte. Reste von Schlüsselhöhlen werden in Stäbchen dargestellt. c Alkanhydroxylierungsaktivitäten von FtAlkB-Mutanten auf Oktan, normalisiert auf Wildtyp (Mittelwert ± SEM; n = 3 unabhängige Experimente). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Unter den Resten der Vestibülauskleidung sind drei Leucinreste, L274, L315 und L318, hoch konserviert (ergänzende Abbildung 1). L274 und L318 interagieren mit dem Alkan in der Nähe seines Terminus (der Oxidationsstelle) von der gegenüberliegenden Seite. Diese beiden Reste tragen somit dazu bei, das Alkan richtig für die katalytische Reaktion zu positionieren. L315, das sich im distalen Teil des hydrophoben Hohlraums befindet, kontaktiert ebenfalls das Alkan (Abb. 3b). Darüber hinaus verknüpft das konservierte L315X2L318-Motiv eine hydrophobe Helix (H4) mit dem letzten histidinreichen Motiv (H321X2HH325). In unseren Funktionsstudien wurde durch den Ersatz von L274 oder L318 durch Tryptophan die katalytische Aktivität von FtAlkB aufgehoben (Abb. 3c). Andererseits hatte die L315W-Substitution nur geringe Auswirkungen auf die Aktivität. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Seitenkettengröße für L274 und L318 und stehen im Einklang mit ihrer vorgeschlagenen Rolle bei der Positionierung des Substrats für das aktive Zentrum. Der distale Bereich des Substratkanals, in dem sich L315 befindet, ermöglicht möglicherweise eine größere Variabilität während der Katalyse.

Im Substratvorhof sitzt W62 an einer strategischen Position und dichtet an das letzte Segment des Alkans an. W62 und L141 (die von der anderen Seite mit dem Alkan-Terminus interagieren) definieren einen schmalen Teil des Vestibüls. Dieser schmale Bereich könnte eine Hürde für die Unterbringung von Alkanen mit mehr als 12 Kohlenstoffatomen darstellen. Bemerkenswerterweise zeigten frühere Studien, dass die äquivalente Position von W62 in GPo1AlkB (W55) mit der unterschiedlichen Fähigkeit von Bakterien korreliert, auf Alkanen zu wachsen: GPo1AlkB und seine engen Homologen mit Tryptophan in dieser Position können auf Alkanen mit 5 bis 12 Kohlenstoffatomen wachsen Die optimale Alkankettenlänge liegt bei etwa 8. Im Gegensatz dazu können AlkBs, die einen kleinen hydrophoben Rest (A, V, L oder I) an derselben Position besitzen, längere Alkane metabolisieren, insbesondere solche mit mindestens 12 Kohlenstoffatomen44,49,51 . Diese Beobachtungen stimmen mit der wichtigen Rolle von W62 überein.

Um die Hypothese weiter zu testen, dass die Reste, die den Substratkanal einschränken, die Substratselektivität bestimmen, haben wir die Aktivität von FtAlkB und seiner W62V-Variante auf Alkane im Bereich von 5–14 Kohlenstoffatomen untersucht (Abb. 4a, b und ergänzende Abb. 5a). FtAlkB ist auf Alkane mit 6–12 Kohlenstoffatomen aktiv, mit optimaler Aktivität auf Heptan und Oktan. Bei Alkanen mit >12 Kohlenstoffatomen beobachteten wir keine nachweisbare Aktivität. Die W62V-Variante verschob die Substratselektivität deutlich: Sie zeigte deutlich erhöhte relative Aktivitäten für längerkettige Alkane wie Decan, Undecan und Dodecan. Die W62V-Mutante kann auch Tridecan und Tetradecan oxidieren. Unsere Experimente mit GPo1AlkB zeigten einen ähnlichen Trend (ergänzende Abbildung 5b). Interessanterweise zeigte eine aktuelle Mutagenesestudie an D. cinnamea AlkB, dass der Austausch einer weniger sperrigen Aminosäure an der Position, die FtAlkBs W62 entspricht, in eine sperrigere Aminosäure (V91W) die Aktivitäten an längeren Alkanen verringerte52. Diese Ergebnisse unterstreichen die wichtige Rolle, die die Seitenkettengröße dieser Position bei der Bestimmung der Länge optimaler Substrate spielt.

a, b Alkanhydroxylierungsaktivitäten von WT (a) und W62V (b) an geraden Alkanen im Bereich von 5 bis 14 Kohlenstoffatomen (Mittelwert ± SEM; n = 4 unabhängige Experimente für WT, n = 3 unabhängige Experimente für W62V). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. c Mögliche seitliche Wege für den Substrateintritt oder die Produktfreisetzung. Dodecan ist orange dargestellt. Schlüsselreste sind in Cyan-Stäbchen dargestellt und ausgewählte kurze Helices sind in Rot dargestellt.

Alle diese Ergebnisse zusammen stimmen mit einem Modell überein, bei dem jedes AlkB einen Substratkanal entwickelt hat, der der Größe seiner Zielalkane genau entspricht, ähnlich wie ein langer Abendhandschuh eng an Hand und Arm anliegt, der hineingleitet.

Unsere Struktur von FtAlkB enthüllt die Architektur dieser Familie wichtiger Enzyme. AlkB nimmt eine Proteinfaltung an, die bisher experimentell nicht beobachtet wurde, während es eine insgesamt konservierte Dimetallkoordinationsgeometrie mit Membranfettsäuredesaturasen und Sphingolipid-α-hydroxylasen teilt. Das AlphaFold53-Modell (AF-A0A1I2KHB9-F1) stimmt gut mit unserer FtAlkB-Struktur überein (mittlere quadratische Abweichung (rmsd) = 1,163 Å, ergänzende Abbildung 4e) und demonstriert damit seine Fähigkeit, eine unbekannte Strukturfalte vorherzusagen. Andererseits schränkt das Fehlen von Metallionen in der von AlphaFold vorhergesagten Struktur ihre katalytischen Erkenntnisse ein.

Unsere Struktur- und Funktionsstudien liefern wichtige Erkenntnisse darüber, wie AlkB Substratselektivität erreicht. Die terminale Methylgruppe des Substrats befindet sich in der Nähe des aktiven Dieisenzentrums. Eine sperrige Aminosäure ~13 Å vom aktiven Zentrum entfernt unterscheidet AlkBs, die bevorzugt Alkane mit etwa acht Kohlenstoffatomen oxidieren, von solchen, die längere Alkane effizient oxidieren (und gleichzeitig kürzere Alkane weniger effizient oxidieren54), die an dieser Position einen weniger sperrigen Rest haben. Es ist denkbar, dass die sperrige Aminosäure als Barriere für längere Alkane dient und gleichzeitig dabei hilft, unpolare Alkane optimaler Größe an Ort und Stelle zu halten54. Möglicherweise könnten andere Strukturmerkmale im Substratkanal für zusätzliche Unterscheidung sorgen. Unsere Struktur bietet somit eine Grundlage für zukünftige Bemühungen, AlkB für biotechnologische Anwendungen zu entwickeln.

In unserer AlkB-Struktur interagiert TM2, das das distale Ende des Substrats verankert, nicht mit benachbarten TMs auf der zytosolischen Seite und hinterlässt seitliche Öffnungen zur Lipiddoppelschicht. Jede Öffnung wird durch eine hydrophobe Helix parallel zur Membran geschützt, was auf ein mögliches Tor schließen lässt, das den Substrateintritt oder die Produktfreisetzung ermöglicht (Abb. 4c). Dies deutet darauf hin, dass TM2 einen lateralen Weg steuern könnte, der es Substraten ermöglicht, in den Kanal einzudringen und Produkte, ihn zu verlassen. Ein solches seitliches Tor würde es Alkanen, die sich in die Membran verteilen, ermöglichen, über die formangepassten Substratkanäle von AlkB das aktive Zentrum zu erreichen. In ähnlicher Weise würden die Alkoholprodukte nach der Reaktion auf demselben Weg freigesetzt, sodass sie über das Fettsäureoxidationssystem weiter oxidiert werden könnten, um dem Bakterium Energie und eine Kohlenstoffquelle bereitzustellen.

Die selektive CH-Bindungsaktivierung ist ein heiliger Gral der Chemie55. Daher ist die Art und Weise, wie Mitglieder der FADS-ähnlichen Superfamilie CH-Aktivierungschemie betreiben, seit langem Gegenstand intensiven Interesses. Unsere Struktur liefert wertvolle Einblicke in diesen Prozess. In unserer Struktur positioniert AlkB die terminale Methylgruppe in der Nähe des aktiven Dieisenzentrums. Bei den Fettsäuredesaturasen sind interne CC-Bindungen so positioniert, dass sie desaturiert werden. Zusammengenommen legen diese Beobachtungen nahe, dass Mitglieder der FADS-ähnlichen Superfamilie lange Alkylkettensubstrate in einem Substratkanal so positionieren, dass die zu brechenden Bindungen neben dem aktiven Zentrum liegen. Es wird angenommen, dass durch Katalyse ein gemeinsames hochvalentes Zwischenprodukt entsteht, das sich zur Entsättigung oder Hydroxylierung aufspalten kann.

Wir und andere hatten die Hypothese aufgestellt, dass die FADS-ähnliche Superfamilie ein katalytisch kompetentes Zwischenprodukt erzeugt, das der Verbindung Q des anderen gut charakterisierten Dieisen-CH-aktivierenden Enzyms sMMO54,56,57,58,59 ähnelt. Es wurde angenommen, dass zwei Eisenionen von AlkB elektronisch verbunden würden, um einen energetischen Vorteil bei der gemeinsamen Nutzung der elektronenarmen Zwischenprodukte zu schaffen, die erforderlich sind, um ein Wasserstoffatom von einer starken CH-Bindung zu abstrahieren. Unerwarteterweise zeigt unsere Struktur, dass das stickstoffreiche aktive Zentrum von AlkB einen großen Abstand zwischen den beiden Eisenionen aufweist und keinen Brückenliganden aufweist. Diese Konfiguration unterscheidet sich grundlegend vom sauerstoffreichen Nicht-Häm-Dieisenzentrum von sMMO. Stattdessen ähnelt das aktive Zentrum von AlkB dem von Membranfettsäuredesaturasen und Sphingolipid-α-hydroxylasen (unabhängig von gebundenem Eisen oder zufällig eingebauten Zinkionen in diesen beiden Enzymen). Diese beobachteten vergleichbaren Konfigurationen des aktiven Zentrums mehrerer verschiedener Enzyme unter unterschiedlichen Bedingungen legen den Schluss nahe, dass sich das von Histidinresten in der FADS-ähnlichen Superfamilie gebildete Dieisenzentrum ausreichend von dem von sMMO unterscheidet, um ein bestimmtes katalytisches Zwischenprodukt zu erfordern.

Die hier vorgestellte Struktur ermöglicht uns in Kombination mit früheren mechanistischen Arbeiten unserer Gruppe Spekulationen über den Mechanismus von AlkB (46, 54, 58, 59, 60, 61) (ergänzende Abbildung 6). Der beobachtete große Abstand zwischen den beiden Eisenionen lässt auf einen Mechanismus schließen, bei dem die beiden Eisen unterschiedliche Rollen spielen, wobei ein Eisen als Elektronenrelais und Stelle für die Wasserbindung dient, während das andere Eisenion als Ort der Katalyse dient. Der protonengekoppelte Elektronentransfer (PCET) von einer Fe(II)-OH2-Spezies auf dem ersten Eisenion zum zweiten Eisenion, an dem O2 gebunden ist, würde eine Eisenperoxospezies und eine Eisenhydroxidspezies bilden, die leicht protoniert werden würden. Die heterolytische Spaltung der OO-Bindung würde auf einem Eisen eine Eisenhydroxospezies, auf dem anderen Eisen Wasser und das katalytisch kompetente Fe(V)-Oxo bilden. Diese Hypothese wird durch die Tatsache gestützt, dass das einzige andere Metalloenzym mit einer mit AlkB vergleichbar langen Lebensdauer des Substratradikals die Naphthalindioxygenase (NDO) ist, bei der eine formal Fe(V)-Oxospezies als aktive Spezies postuliert wird62. Wie bei Mn(V)-Oxospezies beobachtet wurde, beeinflusst die elektronische Struktur der zurückprallenden Spezies (im Fall von AlkB Fe(IV)-OH) die Radikallebensdauer63. Es bleibt auch möglich, dass es während der Reaktion zu einer erheblichen Neuordnung des aktiven Zentrums kommt, die in unserer Struktur nicht zu sehen ist, was zu einem eher sMMO-ähnlichen Reaktionsmechanismus führen könnte64. Eine detaillierte spektroskopische Charakterisierung von Reaktionszwischenprodukten wird Gegenstand künftiger Arbeiten sein.

DNA, die für FtAlkB (Aminosäuren 4–399) kodiert, wurde codonoptimiert und in den pRSF-Vektor (Novagen) kloniert. Das Protein wurde in E. coli BL21 (DE3) überexprimiert. Die Zellen wurden bei 37 °C gezüchtet und durch 0,2 mM IPTG in Gegenwart von 10 mg/l Fe3+ bei 30 °C für 5 Stunden induziert. Pelletierte Zellen wurden in Lysepuffer (20 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 20 mM Imidazol) resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. FtAlkB wurde durch 1 % DDM (Anatrace) 1 Stunde lang bei 4 °C solubilisiert und dann aus dem geklärten Überstand durch Kobaltharz isoliert. Nach dem Verdau über Nacht mit 3 C-Protease wurde der FtAlkB-Eluent mit Nanobody AP32 im Molverhältnis 1:2 inkubiert. Der Komplex wurde durch Größenausschlusschromatographie (SEC) auf einer Superdex 200-Anstiegssäule (GE Healthcare) in Puffer mit 20 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl und 0,02 % DDM gereinigt und einer Kryo-EM-Analyse unterzogen.

AlkB exprimierende Zellen wurden zentrifugiert und in Lysepuffer resuspendiert und durch einen einzigen Hochdruckdurchgang in der French Press aufgebrochen und dann 20 Minuten bei 7000 × g zentrifugiert. Zu 0,5 ml Zellüberstand wurden 0,5 ml Zellüberstand von AlkG- und AlkT-exprimierenden Zellen und 2 μl gereinigtes Substrat hinzugefügt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von ausreichend NADH gestartet, um eine Arbeitskonzentration von 12,3 mM zu erreichen. Die Tests wurden unter Schütteln 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit wurde die Reaktion mit 100 μL CHCl3 gequencht. Die Mischung wurde 1 Minute lang gevortext und dann 5 Minuten lang bei 16.200 × g zentrifugiert. Die organische Schicht wurde mit einem massenselektiven Detektor (MSD) Agilent 5977E in die Gaschromatographie Agilent 7820 A übertragen und injiziert. 1 μl Probe wurde in eine Agilent HP-5-Säule mit einer Injektortemperatur von 275 °C und einem Aufteilungsverhältnis von 25:1 injiziert. Die anfängliche Ofentemperatur betrug 45 °C mit einer Haltezeit von 2,25 Minuten. Anschließend wurde die Ofentemperatur mit einer Geschwindigkeit von 10 °C pro Minute auf eine Endtemperatur von 225 °C erhöht. Die Identität jeder Verbindung wurde durch manuellen Vergleich des Fragmentierungsmusters jedes Peaks mit dem eines authentischen Standards bestimmt, der unter identischen Bedingungen injiziert und gleichzeitig eluiert wurde. Die Spitzenintensitäten wurden durch manuelle Integration des Gesamtionenstroms (TIC) mit MSD ChemStation F.01.03.2357 bestimmt. Alle Aktivitätstests umfassten eine Kontrolle mit Substrat + Puffer und eine Kontrolle mit AlkG, AlkT, NADH und Substrat. Gereinigte Proteine ​​wurden auf ähnliche Weise untersucht, mit der Ausnahme, dass gereinigtes AlkG, Ferredoxinreduktase aus Mais und NADPH verwendet wurden46,65.

Gereinigte Proteine ​​wurden über Nacht in 50 % HNO3 verdaut und dann 30 Minuten lang gekocht. Die Proben wurden mit Milli-Q-Wasser auf 5 % HNO3 verdünnt und einem ICP-MS-Spektrometer (Thermo Scientific XSERIES 2) unterzogen. AlkB-Proteine ​​und die Negativkontrolle, der nicht eisenhaltige semiSWEET-Transporter, wurden parallel hergestellt. Zur Kalibrierung wurden Eisenstandards verwendet.

FtAlkB-spezifische Nanokörper wurden aus einer synthetischen Nanokörperbibliothek gemäß veröffentlichten Protokollen generiert66,67. Nach drei Selektionsläufen wurden einzelne Nanokörperkandidaten sequenziert und in E. coli BL21 (DE3) exprimiert. Gereinigte Nanokörper wurden anhand ihrer Bindungsfähigkeit an FtAlkB durch Pulldown-Assay und analytische SEC validiert. Es wurde festgestellt, dass der Nanokörper AP32 mit FtAlkB einen stabilen Komplex bildet. Der Komplex wurde Kryo-EM-Studien unterzogen.

Zur Probenvorbereitung wurden 3 μl konzentriertes FtAlkB (19 mg/ml) auf frisch glimmentladenen löchrigen Kohlenstoffgittern (Quantifoil Au R1.2/1.3 300 Mesh) 5 s lang inkubiert, geblottet (Zeit 3, Kraft 3) und dann kryogekühlt in flüssigem Ethan auf einem Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) bei 4 °C und 100 % Luftfeuchtigkeit. Die Gitter wurden auf einem 300-kV-Titan-Krios mit Falcon-4-Detektor und Selectris-Energiefilter (Spaltbreite 10 eV) überprüft. Während einer Belichtungszeit von 8,14 s wurden 50 Filmbilder mit der EPU-Software (Thermo Fisher Scientific) bei einer physikalischen Pixelgröße von 0,95 Å mit einer Defokussierung von 1,6 μm bis 2,2 μm und einer Elektronenbelichtungsdosis von 50 Elektronen pro Å2 gesammelt.

Insgesamt 5072 Filme wurden mit MotionCorr268 bewegungskorrigiert, was dosisgewichtete Bilder und summierte Bilder ergab. Die dosisgewichteten Bilder wurden in cryoSPARC v3.369 importiert und verarbeitet. Die Kontrastübertragungsfunktion (CTF) von Bildern wurde durch Patch-CTF-Schätzung geschätzt. Es wurden Bilder mit einer CTF-Auflösung von mehr als 8 Å ausgewählt, was 4.965 Bilder ergab. Ein halber Datensatz wurde zur automatischen Auswahl anhand von Vorlagen verwendet, die vom Blob-Picker generiert wurden. Nach der 2D-Klassifizierung wurden 51.617 Partikel mit unterschiedlichen Ansichten für das Training in Topaz v0.2.470 verwendet. Anschließend wurden insgesamt 1.739.854 Partikel mit einer Boxgröße von 160 Pixeln und 2 × 2-Binning extrahiert und einer 2D-Klassifizierung, heterogenen Verfeinerung und Ab-Initio-Rekonstruktion unterzogen. Die wohldefinierte Teilmenge von 242.089 Partikeln wurde mit einer Boxgröße von 224 Pixeln erneut extrahiert und verfeinert, um eine 4,47 Å-Karte in ungleichmäßiger Verfeinerung mit den Einstellungen einer anfänglichen Tiefpassauflösung von 12 Å und aktivierter Minimierung über die Skala pro Partikel zu erhalten und fünf zusätzliche letzte Pässe. Zur weiteren Verbesserung der Dichte wurde eine Seed-unterstützte geführte Multireferenz-3D-Klassifizierung durchgeführt71. Zu den Mehrfachreferenzen gehören genaue und voreingenommene Referenzen, die durch Ab-Initio-Rekonstruktion generiert wurden, Auflösungsgradientenkarten (4,47 Å-Karte und zwei weitere Karten mit tiefpassgefilterter Auflösung von 10 Å und 20 Å) und neu gewichtete Rauschkarten (4,47 Å). Karte und zwei weitere Karten, deren Mizelle um den Faktor 0,3 und 0,7 verkleinert wurde. Nach der Ab-Initio-Rekonstruktion und der Entfernung duplizierter Partikel wurden 253.772 Partikel erneut extrahiert und einer heterogenen Verfeinerung mit nur neu gewichteten Rauschkarten unterzogen, was zu 3,84 Å führte. Die resultierenden 145.869 Partikel und 242.089 Partikel aus der Erstverarbeitung wurden kombiniert. Duplikate wurden nach einer Runde heterogener Verfeinerung entfernt. Nach weiteren zwei Runden heterogener Verfeinerung ergaben insgesamt 107.776 Partikel eine Karte bei 3,72 Å. Die endgültige Karte wurde bei 3,59 Å für FtAlkB-Nanokörper oder 3,45 Å für FtAlkB über lokale Verfeinerung und lokale CTF-Verfeinerung rekonstruiert (FSC = 0,143). Diese Karte wurde jeweils von DeepEMhancer72 für eine bessere Nanokörperdichte und von CryoSPARC für eine bessere Ligandendichte geschärft. Die lokale Auflösung wurde von BlocRes in cryoSRARC berechnet.

Das AlphaFold253 FtAlkB-Modell wurde in Chimera in die Dichte eingepasst und in Coot73 manuell neu erstellt. Ein Nanokörpermodell von PDB 7SL8 wurde in die Kryo-EM-Karte eingepasst und die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) wurden mithilfe der AlphaFold2-Vorhersage manuell neu erstellt. Das FtAlkB-Nanobody-Modell wurde in Phenix74 verfeinert und von MolProbity evaluiert. Die in der Ergänzungstabelle 1 angegebenen Verfeinerungsstatistiken basieren auf der DeepEMhancer-Sharpend-Karte. Die Abbildungen wurden mit PyMOL (Schrödinger, LLC)75, UCSF Chimera76 oder ChimeraX77 erstellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Daten, die diese Studie unterstützen, sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Die FtAlkB-Nanobody-Karte wurde in der Electron Microscopy Data Bank (EMDB) unter dem Zugangscode EMD-40303 (FtAlkB-Nanobody) hinterlegt. Das FtAlkB-Nanobody-Modell befindet sich in der Protein Data Bank (PDB) unter 8SBB. Zuvor veröffentlichte Strukturmodelle wurden von PDB unter Verwendung der Zugangscodes 6WF2, 4ZR1, 7SL8 heruntergeladen. Quelldaten zu Abb. 1b, c, 3c, 4a, b und die ergänzende Abbildung 5b sind diesem Dokument beigefügt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Vielen Dank an Jacob Austin, der bei der Entwicklung des Aktivitätstests mitgeholfen hat. Vielen Dank an viele Studenten der Austin-Gruppe für die fruchtbaren Diskussionen über die Struktur und Funktion von AlkB in den letzten 20 Jahren. Vielen Dank an Jamie Ross für die Hilfe bei der ICP-MS-Datenerfassung. SW und JL waren Empfänger von Beckman-Stipendien. Ein besonderer Dank geht an Professor Jay T. Groves, dessen Laborarbeit zu AlkB im Rahmen eines von der NSF finanzierten Zentrums für bioanorganische Umweltchemie (CEBIC NSF9810248) begann und dessen intellektuelles Engagement bei dieser Arbeit von unschätzbarem Wert war. Diese Arbeit wurde durch die Unterstützung von NIH R01 GM130989 (RNA & LF) ermöglicht. Die Mittel für den Kauf der ersten DNA, die im groß angelegten AlkB-Screening verwendet wurde, stammten aus einem Presidential Research Award für RNA des Barnard College. Einige dieser Arbeiten wurden am Stanford-SLAC Cryo-EM Center (S2C2) durchgeführt, das vom NIH Common Fund Transformative High-Resolution Cryo-Electron Microscopy-Programm (U24 GM129541) unterstützt wurde. Die Arbeit im Austin-Labor wird auch durch eine großzügige Spende von Roy und Diana Vagelos unterstützt, die wir ebenfalls dankbar anerkennen.

Juliet Lee

Aktuelle Adresse: Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, California Institute of Technology, Pasadena, CA, 91125, USA

Shoshana C. Williams

Aktuelle Adresse: Department of Chemistry, Stanford University, Stanford, CA, 94305, USA

Allison Forsberg

Aktuelle Adresse: Department of Chemistry, University of Southern California, Los Angeles, CA, 90007, USA

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Xue Guo, Jianxiu Zhang, Lei Han.

Abteilung für Molekular- und Zellphysiologie, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, 94305, USA

Xue Guo, Jianxiu Zhang, Lei Han, Yan Xu und Liang Feng

Fakultät für Chemie, Barnard College, 3009 Broadway, New York, NY, 10027, USA

Juliet Lee, Shoshana C. Williams, Allison Forsberg und Rachel Narehood Austin

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XG und JL führten ein erstes Screening und eine Kandidatenüberprüfung durch. XG, LH und JZ führten Kryo-EM-Studien durch. XG, LH und YX führten ICP-MS durch. JL, SW, AF und RNA führten Funktionsstudien durch. RNA und LF leiteten das Projekt. XG, RNA und LF haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Rachel Narehood Austin oder Liang Feng.

Die Autoren erklären kein konkurrierendes Interesse.

Nature Communications dankt Rhys Grinter und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Guo, X., Zhang, J., Han, L. et al. Struktur und Mechanismus des alkanoxidierenden Enzyms AlkB. Nat Commun 14, 2180 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37869-z

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Eingegangen: 23. März 2023

Angenommen: 03. April 2023

Veröffentlicht: 17. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37869-z

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