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Jun 05, 2023

Ein neuartiges pH-empfindliches theranostisches PLGA-Nanopartikel für die Borneutroneneinfangtherapie bei der Mesotheliombehandlung

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 620 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Ziel dieser Studie ist die Entwicklung von Polymilch-Co-Glykolsäure (PLGA)-Nanopartikeln mit einem innovativen bildgebenden Ansatz auf Basis der Bor-Neutronen-Einfangtherapie zur Behandlung von Mesotheliomen. Die hier berichteten Ergebnisse zeigen, dass PLGA-Nanopartikel mit Oligo-Histidin-Ketten und dem dualen Gd/B-Theranostikum AT101 erfolgreich genutzt werden können, um eine therapeutische Dosis Bor an Mesotheliomzellen abzugeben, die deutlich höher ist als bei gesunden Mesothelzellen, wie durch ICP ermittelt. MS und MRT. Die selektive Freisetzung ist pH-abhängig und nutzt den leicht sauren pH-Wert der extrazellulären Umgebung des Tumors aus. Sie wird durch die Protonierung der Imidazolgruppen von Histidin ausgelöst. Nach der Bestrahlung mit thermischen Neutronen wurden das Überleben von Tumorzellen und gesunden Zellen sowie die klonogene Fähigkeit bewertet. Die erzielten Ergebnisse erscheinen sehr vielversprechend und bieten Patienten, die von dieser seltenen Krankheit betroffen sind, eine verbesserte Therapieoption unter Nutzung von PLGA-Nanopartikeln.

Das maligne Mesotheliom (MM) ist ein aggressiver Tumor mit schlechter Prognose, dessen Inzidenz und Mortalität von der früheren Asbestexposition abhängt, selbst nach einer Latenzzeit von 30–50 Jahren. MM gilt als seltene Berufskrankheit, für die es keine wirksame Therapie gibt, und die mittlere Überlebenszeit nach der Diagnose beträgt weniger als 9–12 Monate1,2. MM ist ein disseminierter Tumor, der sich innerhalb der gesamten Pleura oder des Peritoneums ausbreitet. Herkömmliche Strahlentherapien haben aufgrund mehrerer strahlenempfindlicher Gewebe eine begrenzte Wirksamkeit, wodurch die maximale Dosis, die an die bösartigen Knötchen abgegeben werden kann, begrenzt ist. Heutzutage stellen zielgerichtete Therapien einen der Hauptschwerpunkte der Krebsforschung dar, und es wird erwartet, dass aus diesem Ansatz viele zukünftige Fortschritte in der Krebsbehandlung resultieren. Eine wirksame, auf molekularem Targeting basierende Therapie gegen MM existiert jedoch noch nicht. Grundsätzlich bleibt es für Ärzte eine Herausforderung, eine frühe MM-Diagnose durchzuführen, da es an Kenntnissen über genaue MM-Biomarker mangelt. Trotz zahlreicher Studien zur Suche nach geeigneten Biomarkern in Blut und Pleuraergüssen haben diese Bemühungen noch kein wirksames Diagnoseinstrument hervorgebracht3,4. Daher bleibt die Standardbehandlungsoption eine invasive Biopsie, gefolgt von einer Chemotherapie mit Cisplatin und Pemetrexed, mit oder ohne Bevacizumab5, mit vielen Nebenwirkungen und geringer Wirksamkeit. In diesem Zusammenhang können Polymernanopartikel eine gute Option für die Abgabe von Arzneimitteln und Bildgebungsmitteln an Mesotheliom-Krebszellen sein, wodurch die therapeutische und diagnostische Wirksamkeit verbessert und die Toxizität außerhalb des Ziels verringert wird6. Nanopartikel können aufgrund der lokal erhöhten Permeabilität und Retentionswirkung Medikamente gezielt an der Tumorstelle freisetzen. Unter den verschiedenen biologisch abbaubaren Polymeren, die in letzter Zeit große Aufmerksamkeit erregt haben, wurden Polymilch-Co-Glykolsäure-Nanopartikel (PLGA-NPs) als Wirkstoffe für die Krebsbehandlung vorgeschlagen7,8,9,10. Unter den von der US-amerikanischen FDA zugelassenen Arzneimittelverabreichungssystemen gehören PLGAs aufgrund ihrer kontrollierten und verzögerten Freisetzungseigenschaften, ihrer geringen Toxizität und ihrer Biokompatibilität mit Gewebe und Zellen zu den wirksamsten biologisch abbaubaren Polymeren. In diesem Artikel haben wir die PLGA-NPs mit einer dualen Therapie-Diagnose-Verbindung beladen, die ein Gd-basiertes Magnetresonanztomographie-Kontrastmittel (MRT) und eine Carboran-Einheit (ikosaedrische lipophile Cluster mit Boratomen) trägt, die für die Neutroneneinfangtherapie (NCT) verwendet wird. . NCT ist ein Beispiel für eine gezielte Therapie mit guter Wirksamkeit und geringer Toxizität, die einen tumorselektiven Zelltod bewirkt11,12,13. Genauer gesagt kann diese Therapie die Bestrahlung mit thermischen Neutronen niedriger Energie mit der Anwesenheit borhaltiger Wirkstoffe in den betroffenen pathologischen Geweben kombinieren. Neutronen werden von nichtradioaktivem 10B eingefangen, was eine zerfallende Kernreaktion auslöst, bei der Alphateilchen und 7Li freigesetzt werden, was einen hohen biologischen Schaden mit einem Durchmesser von etwa 10 µm verursacht, was weniger als der durchschnittliche Durchmesser einer Säugetierzelle ist. Daher kann NCT durch die Verabreichung von Bor und die selektive Erzeugung von Alphastrahlung in erkrankten Zellen die pathologischen Zellen abtöten und gleichzeitig das umliegende gesunde Gewebe schonen. Diese Eigenschaften machen BNCT zu einer vielversprechenden Behandlung für diffuse Metastasen und infiltrierende Tumoren wie Mesotheliome, die nicht behandelt werden können oder gegen Methoden resistent sind, die normalerweise bei einer lokalisierten Tumormasse angewendet werden, wie beispielsweise konventionelle Strahlentherapie oder Operation14. BNCT wurde bei Hautmelanomen, Gehirn-, Kopf- und Halstumoren angewendet und eine große Menge klinischer Daten wurde im Rahmen verschiedener klinischer Studien (Phase I/II) in Japan, den USA, den Niederlanden, Schweden, Finnland und Argentinien gesammelt und Taiwan15,16. Nakamura und Mitarbeiter haben kürzlich eine Hyaluronsäure entwickelt, die Natriummercaptoundecahydro-closo-dodecaborat (BSH) enthält und in präklinischen Mausmodellen speziell an MM abgegeben wird17. Darüber hinaus wurde im Jahr 2006 in Japan eine kleine Anzahl von MM-Patienten sicher mit BNCT behandelt, wodurch eine deutliche Linderung der Symptome erreicht wurde18. Um die Wirksamkeit von BNCT zu erreichen, müssen die Borträger jedoch unterschiedliche Bedingungen erfüllen: (i) geringe systemische Toxizität; (ii) hohe Selektivität für Tumorzellen; (iii) lange Halbwertszeit innerhalb des Tumors für die Dauer der Behandlung. Es wurde geschätzt, dass etwa 10–30 μg B pro Gramm Tumormasse erforderlich sind, um eine wirksame Behandlung zu erreichen, wobei eine tolerierbare Bestrahlungsdauer und eine geeignete Neutronenquelle verwendet werden19. Die beiden Verbindungen, die derzeit in klinischen Studien verwendet werden, sind p-Borono-l-phenylalanin (BPA) (verwendet in Studien für Glioblastome, Kopf- und Halskrebs und Melanome) und BSH (zur Behandlung von Hirntumoren bestimmt). Diese Wirkstoffe führen zu einem Borkonzentrationsverhältnis zwischen Tumor und normalem Gewebe zwischen 3 und 6, was eine sichere und recht wirksame Behandlung ermöglicht. In der wissenschaftlichen Gemeinschaft herrscht jedoch die weit verbreitete Meinung vor, dass eine breitere klinische Anwendung der BNCT möglich sein wird, wenn die Aufnahme in Tumorzellen weiter verbessert wird19. Als Beispiel für eine erfolgreiche Targeting-Strategie wurden von unserer Gruppe mit AT101 beladene Low-Density-Lipoproteine ​​(LDL) als endogener Lipidträger für die spezifische Abgabe von Bor an verschiedene Arten von Tumoren wie Melanomen20 und pulmonalen Brustmetastasen21 vorgeschlagen Mesotheliom22. AT101 (Schema 1) ist ein duales Mittel, das eine Carboran-Einheit enthält, die mit einem Gd-basierten Kontrastmittel funktionalisiert ist. Unter den Borderivaten nehmen Carborane eine Sonderstellung ein, sowohl aufgrund ihres hohen Borgehalts (10 B-Atome) als auch ihrer chemischen Vielseitigkeit gepaart mit einer hohen In-vivo-Stabilität23,24,25,26.

Schematische Darstellung von PLGA-His-Nanopartikeln.

In dieser Studie wurden PLGA-Nanopartikel, die mit einer einzigartigen Aminosäuresequenz bestehend aus 15 Histidinresten (His) (CGGH15βA) funktionalisiert sind, nämlich PLGA-His, für die kontrollierte Freisetzung des B-haltigen Wirkstoffs in der Nähe der Tumormikroumgebung entwickelt ein pH-ausgelöster Mechanismus. Tatsächlich beträgt der pKa-Wert von Histidin in seiner oligomeren Form etwa 6,827, sodass der Imidazolring bei einem pH-Wert unter 7 protoniert wird. Dies geschieht auch, wenn das Oligo-His an eine PLGA-Polymerkette konjugiert ist und ein stabiles Nanopartikel bildet28. Dies wurde durch das Vorhandensein von 14N Histidinatomen nachgewiesen, die eine quadrupolare Relaxationsverstärkung (auch Quadrupolar Peak, QP genannt) bei 1,39 MHz verursachen, die mit einem Fast Field Cycling NMR-Relaxometer28 gut nachweisbar ist. Die Entspannungsverstärkung ist im Bereich von 6,5–7,5 pH-abhängig und fungiert somit als Reporter der Nanopartikel- oder Gerüstintegrität28,29. Da nachgewiesen wurde, dass in der Krebs-Mikroumgebung der pH-Wert verändert ist und saurer als der physiologische Wert ist30, schlagen wir hier die Verwendung dieser B- und Gd-haltigen pH-empfindlichen Nanopartikel vor, die selektiv mit Zellmembranen interagieren, um den eingekapselten Wirkstoff freizusetzen die Nähe von Tumorgewebe. Über die Verwendung von Polyhistidin-konjugierten Polymer-Hybridmaterialien für die pH-abhängige Abgabe von Doxorubicin wird bereits in der Literatur berichtet31,32. Darüber hinaus wurde in dieser Studie die pH-ausgelöste selektive Abgabe von B- und Gd-haltigen theranostischen NPs für eine selektive Mesotheliombehandlung mit BNCT verwendet. Das Vorhandensein von Gd-basierten MRT-Reportern33 ermöglicht die indirekte quantitative Bestimmung von Bor am Zielort vor und während der Neutronenbestrahlung33,34,35,36. Dieser Ansatz könnte neue Therapiestrategien für MM-Patienten eröffnen und zu besseren Behandlungsergebnissen in Bezug auf Überlebenszeit und Lebensqualität führen.

PLGA Resomer® RG 502 H, Mowiol 4–88 (Poly(vinylalkohol), Mw ~ 31.000), DSPE-PEG(2000)methoxy(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N[methoxy(polyethylen). Glykol)-2000] und alle anderen Chemikalien und Lösungsmittel wurden von Merk Life Science Srl (Mailand, Italien) bezogen.

Oligo-His-PLGA wurde gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren hergestellt28. Kurz gesagt, die Peptidsequenz CGGH15βA wurde durch automatisierte Festphasen-Peptidsynthese zusammengesetzt und dann an ein PLGA-PEG2-Mal konjugiert, das intern aus PLGA Resomer® RG 502 H und Maleimide-PEG2-NH2 hergestellt wurde. Mit 10B angereichertes AT101 (10B-angereicherter Ligand-C-[N-(DOTAMA-C6)-carbamoylmethyl]C′-palmitamidomethyl-o-carboran) wurde gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren hergestellt37.

PLGA-NPs wurden nach der O/W-Emulsionsmethode erhalten38. Die organische Phase wurde durch Auflösen von 12,5 mg PLGA Resomer® RG 502 H, 12,5 mg Oligo-His-PLGA, 2,2 mg DSPE-PEG(2000)methoxy und 3 mg AT101, gelöst in 0,5 ml 3:1 ( v/v) Chloroform–Methanol. Das PLGA-CTRL wurde nach dem gleichen Verfahren hergestellt, indem 25 mg PLGA RG 502H ohne einen Teil des -Oligo-Histidin-konjugierten Resomers aufgelöst wurden. Die Wasserphase bestand aus 3 ml einer 3 %igen (w/v) wässrigen Mowiol 4–88-Lösung. Die organische PLGA-Lösung wurde tropfenweise mit der PVA-Lösung gemischt und sofort viermal 1 Minute lang bei 4 °C mit 100 % Beschallungsleistung beschallt. Die organische Phase wurde durch Rotationsverdampfung in einem 500-ml-Rundkolben aus Glas für 2 Stunden entfernt. Nach der Verdampfung wurde der nicht eingeschlossene Wirkstoff durch Dialyse (Molekulargewichtsgrenze 14.000 Da) bei 4 °C in 2 l isotonischem NaCl/Hepes-Puffer (HBS) entfernt. Der Überschuss an PVA wurde durch Waschen der NPs-Lösung mit einem Vivaspin 20-Filter (Sartorius AG, Göttingen, Deutschland, Cut-off von 1 × 106 Da) entfernt und am Ende des Waschschritts betrug das Endvolumen 3 ml für alle betrachteten Nanopartikelsuspensionen erreicht. Die in PLGA-Nanopartikeln eingebaute Gd- und B-Menge wurde durch Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS; Element-2; Thermo-Finnigan, Rodano (MI), Italien) nach Probenaufschluss mit konzentrierter HNO3 (70 %, 0,4 ml) gemessen. durch Erhitzen auf 150 °C für 8 Minuten unter einem Mikrowellenaufschlusssystem (ETHOS UP Milestone, Bergamo, Italien). Die Menge an Gd wurde durch 1H-Kernresonanz-R1-Messung bei 21,5 MHz und 25 °C (Stelar Spinmaster, Mede, Italien) der mineralisierten Komplexlösung (in 6 M HCl bei 120 °C für 16 Stunden) doppelt überprüft. Der hydratisierte mittlere Durchmesser und das Z-Potenzial von Nanopartikeln wurden mit einem Malvern Zeta Sizer 3000HS mit dynamischer Lichtstreuung (DLS) bestimmt. (Malvern, UK) Nanopartikel wurden bis zur weiteren Analyse im Dunkeln bei 4 °C gelagert.

Die Stabilität von PLGA-CTRL- und PLGA-His-NPs wurde durch Inkubation beider NPs in 40 ml NaCl/Hepes-Puffer bei pH 6,0 oder 7,4 bei 37 °C unter Dialyse in 14-KDa-Membranen und deren Längsrelaxationsraten (R1 obs.) ermittelt ) wurden nach 3, 6, 24, 48 und 72 h bei 21,5 MHz und 25 °C gemessen.

Die gesunden Mesotheliomzelllinien AB22 der Maus und MeT-5A des Menschen wurden von Sigma bzw. ATCC erworben. AB22-Zellen wurden in RPMI-Medium, ergänzt mit 25 mM Hepes, 10 % FBS, 1 % P/S und 2 mM Glutamin, kultiviert, während MeT-5A in Medium 199, ergänzt mit 10 % FBS, 1 % P/S, 8,7, kultiviert wurden E−4 mM Rinderinsulin, 3,3E−6 mM menschliches EGF, 4E−4 mM Hydrocortison und Spurenelemente B (Corning) und in einem 5 % CO2-Inkubator bei 37 °C aufbewahrt.

5 × 105 AB22- und MeT-5A-Zellen wurden in Petrischalen mit 6 cm Durchmesser ausgesät und dort gehalten, bis 80 % der Konfluenz erreicht waren. Anschließend wurden steigende Konzentrationen von Gd-haltigen PLGA-CTRL- und PLGA-His-Nanopartikeln 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und mit einer Lösung von Tripsin/EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) abgelöst. Anschließend wurden die Zellpellets in 0,2 ml PBS resuspendiert, in Eis beschallt (30 % Leistung, 30 s) und gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren mineralisiert. Die Zellproteine ​​jeder Probe wurden mit dem kommerziellen Bradford-Assay (Biorad) quantifiziert. Die durch ICP-MS gemessenen nmol Gd und B, die von jeder Zellprobe internalisiert wurden, wurden auf die Gesamtzellzahl normalisiert. Die Zellzahl wurde aus den mg Zellproteinen ermittelt, die mit dem Bradford-Assay gemessen wurden, unter Verwendung der Kalibrierungskurve: [(mg Protein)/(Anzahl der Zellen)]. Bei dieser Kalibrierung entsprechen 1 Million AB22 und MeT-5A 0,606 bzw. 0,435 mg Proteinen. Aus ICP-MS-Daten war es möglich, Bor-ppm zu berechnen, indem eine Dichte von ca. angenommen wurde. 108 Zellen pro cm3 bei epithelialen Tumoren (mit einem Durchmesser von 15–20 µm)38.

T1-gewichtete Bilder: Glaskapillaren, die Zellpellets von unbehandelten oder mit NPs (0,0974 mM [Gd]) behandelten AB22 und MeT-5A enthielten, wurden in ein Agar-Phantom gegeben und mittels MRT mit einem Bruker Avance Neo 300 MHz-Spektrometer (7 T) aufgenommen mit einer Mikroimaging-Sonde Micro 2.5 (BrukerBioSpin, Ettlingen, Deutschland). T1W-Bilder wurden unter Verwendung einer Standard-MSME-Sequenz (Multi-Slice Multi-Echo) mit den folgenden Parametern erhalten: TR = 250 ms, TE = 3 ms, FOV = 12 × 12 mm, Schichtdicke = 1 mm, NEX = 6, Matrix Größe 128 × 128.

T25-Flaschen mit AB22 und MeT-5A wurden 24 Stunden lang in Gegenwart von PLGA-CTRL- und PLGA-His-NPs (97 µM [Gd] und 970 µM [B]) behandelt. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit PBS gewaschen und ihr Medium erneuert. Die behandelten Kolben und Kolben, die unbehandelte Kontrollzellen enthielten, wurden 15 Minuten lang bei 30 kW Reaktorleistung in der thermischen Kolonne des TRIGA Mark II-Reaktors an der Universität Pavia, Italien, bestrahlt. Am Ende der Bestrahlung wurde das Medium entfernt, durch frisches Medium ersetzt und die Kolben für weitere 24 Stunden bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 aufgestellt. Am Tag danach wurden die unbehandelten und die behandelten Kolben mit Trypsin/EDTA getrennt und der Trypanblau-Ausschlusstest durchgeführt. Die Lebensfähigkeit bestrahlter unbehandelter und behandelter Zellen wurde mit nicht bestrahlten Zellen verglichen. Der Prozentsatz lebensfähiger Zellen für jeden Zustand wurde berechnet, indem die Anzahl der unbehandelten, nicht bestrahlten Zellen auf 100 % Lebensfähigkeit gesetzt wurde.

Der klonogene Test von bestrahlten und nicht bestrahlten behandelten und unbehandelten Zellen wurde durchgeführt, indem etwa 200 Zellen aus jedem einzelnen Kolben in Kulturschalen mit 6 cm Durchmesser ausgesät wurden. Das Wachstum der Zellen wurde 18 Tage lang verfolgt. Das Medium wurde nach 2–3 Tagen erneuert. Nach 18 Tagen wurden die Zellen mit PBS gewaschen, in Methanol fixiert (25‘) und mit 0,5 % (Gew./Vol.) Kristallviolett in 20 % Ethanol (30‘) gefärbt. Das Kristallviolett wurde vorsichtig entfernt und mit Leitungswasser abgespült. Schließlich wurde die Anzahl der Kolonien mit der ImageJ-Software berechnet. Der Prozentsatz wurde berechnet, indem die bestrahlten Kontrollzellen auf 100 % gesetzt wurden.

Die Konjugation von PLGA mit dem Oligo-His (Oligo-His-PLGA) erfolgte nach einem bereits beschriebenen Verfahren28, das auf einer Thiol-Michael-Additionsreaktion zwischen PLGA-PEG2-Maleimid und einem Oligo-His mit einem N-terminalen Cystein basierte Rest (Aminosäuresequenz: CGGHnβA, n = 15). PLGA-NPs wurden nach der O/W-Emulsionslösungsmittelextraktionsmethode38 unter Verwendung von 100 % des im Handel erhältlichen PLGA (MW = 7–17 kDa; PLGA-CTRL genannt) oder durch Mischen von 50 % dieses PLGA mit 50 % Oligo-His- hergestellt. PLGA (PLGA-His). Das theranostische Mittel AT101 (Schema 1) wurde in die NPs geladen, indem es der organischen Phase mit PLGA-Polymeren zugesetzt wurde. Nach der Dialyse wurde die Menge an AT101, die mit sehr guten Ausbeuten (> 82 %) eingekapselt blieb, durch Messung von B und Gd mittels ICP-MS bestimmt. Die durchschnittlichen hydrodynamischen Durchmesser von PLGA-Nanopartikeln, die millimolare Relaxivität und das durchschnittliche Oberflächenpotential der Nanopartikel sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Das in beiden NPs beobachtete niedrige und leicht negative Z-Potential ist auf die Abschirmwirkung der negativen Ladungen von PLGA zurückzuführen, die sowohl durch die PVA- als auch die DSPE-PEG-Beschichtung verursacht werden39,40. Aus dem gleichen Grund wurde bei PLGA-His bei pH < 6,5 nur ein leichter Anstieg des Z-Potentials gemessen. Darüber hinaus kann ein Teil des protonierten Oligo-His im Partikelkern verbleiben, wodurch ihr Beitrag zum gemessenen Z-Potential verringert wird (Tabelle 1). Die Nanopartikel wurden bei 4 °C gelagert und ihre Größe alle 15 Tage per DLS gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Die Relaxivität (r1p) ist ein Ausdruck der Kontrastmitteleffizienz und entspricht dem paramagnetischen Beitrag zur longitudinalen Relaxationsrate, normiert auf die mM-Konzentration der Gd-Komplexlösung. Sowohl PLGA-CTRL als auch PLGA-His zeigen einen 4–5-mal höheren r1p-Wert (ca. 18 s−1 mM−1, bei 21,5 MHz und 25 °C, Tabelle 1) im Vergleich zu denen, die bei klinisch verwendetem Gd- beobachtet wurden. basierte Kontrastmittel (im Bereich 4–5 mM−1 s−1)41. Dies ist ein Hinweis auf die lange Taumelzeit, die die AT101-Komplexe ausfüllen, wenn sie in den NP geladen werden, und die erhöhte Empfindlichkeit verringert die Nachweisgrenze dieser Bildgebungssonden, wenn sie in einen NP internalisiert werden. Die Stabilität des Abgabesystems bei 37 °C wurde durch 72-stündiges Überwachen der Relaxationsraten von PLGA-NPs-Lösungen sowohl bei physiologischem als auch bei tumoralem pH-Wert in einem Salzpuffer (Hepes-NaCl-Puffer) bewertet. Zu diesem Zweck wurden Lösungen, die PLGA-CTRL und PLGA-His enthielten, 72 Stunden lang bei 37 °C, jeweils bei pH 7,4 und 6,0, unter Dialyse gerührt (Grenzwert 14 KDa). Die Relaxationsraten der PLGA-Lösung in der Dialysemembran wurden nach 3, 6, 24, 48 und 72 Stunden Inkubation gemessen. Obwohl Abb. 1 zeigt, dass PLGA-CTRL unter diesen Bedingungen im Wesentlichen 72 Stunden lang stabil sind, wurde im Fall von PLGA-His aufgrund der Protonierung ein erhöhter R1 (s−1) bei Inkubation bei saurem pH-Wert beobachtet Imidazolgruppen, die in den NPs vorhanden sind, mit einer daraus resultierenden Veränderung seiner physikochemischen Struktur, die zu einer Schwellung des NPs führt, die die Wasserpermeation erleichtert. Die Schwellung des NP wurde durch Messung der Größe von PLGA-CTRL und PLGA-His nach 24-stündiger Inkubation bei pH = 6,0 und 37 °C bestätigt. Obwohl der auf PLGA-CTRL gemessene hydrodynamische Durchmesser nahezu unverändert blieb (149,0 ± 4 nm), stieg der gemessene Durchmesser von PLGA-His bei pH 6,0 (160,4 ± 3,2 nm) um etwa 12 %, was die Schwellung und Zunahme der Nanopartikel bestätigt Volumen. Darüber hinaus zeigen Oligo-Histidinketten, wie in der Einleitung berichtet, aufgrund der 14N-Kernquadrupolresonanzfrequenz der in der Oligomerkette vorhandenen Imidazolgruppen einen charakteristischen Relaxationspeak bei 1,38 MHz, der sich deutlich von den vom Hintergrundgewebe erzeugten QPs unterscheidet. Da der 14N-Quadrupolar-Relaxationspeak möglicherweise nur bei immobilisierten Systemen beobachtet wird, können Änderungen in der Intensität der Imidazol-QPs als Hinweis auf den physikalischen Zustand des Poly-His-Feststoff-/Flüssigkeitsstatus und die Schwellung im Zusammenhang mit dem pH-Wert der Mikroumgebung dienen. In Referenz 28 wurde gezeigt, dass die Protonierung der Imidazolgruppe des Histidins (pKa = 6,8) die Partikelquellung und Polymerlöslichkeit erhöhte, was zu einer Erhöhung der Mobilität und einem fortschreitenden Verschwinden der QPs bei pH < 6,0 führte. Leider waren die QPs im in dieser Arbeit verwendeten PLGA-His nicht nachweisbar, da der geladene paramagnetische Gd-Komplex die Relaxationsrate dramatisch erhöht und zum vorherrschenden Relaxationsprozess wird.

Längsrelaxationsraten (R1, s−1) von HBS-Lösungen, die maximal 72 Stunden lang bei 37 °C gehalten werden und PLGA-CTRL bei pH = 7,4 (O) und pH = 6 (gefüllter Kreis) oder PLGA-His bei pH = 7,4 enthalten ( offenes Quadrat) und pH = 6 (ausgefülltes Quadrat).

Um diese Hypothese zu bestätigen, wurde die Gd-Konzentration in den Lösungen innerhalb der Dialysemembran (1:1 mit Puffer verdünnt) nach 0, 24 und 72 Stunden Inkubation bei 37 °C bei pH 7,4 und 6 gemessen. Die Ergebnisse sind in angegeben Tabelle 3 zeigt, dass nur bei pH 6 eine signifikante AT101-Freisetzung nach 24- und 72-stündiger Inkubation beobachtet wurde, was die verringerte Stabilität des Nanopartikels bei diesem pH-Wert bestätigt.

Aufnahmestudien wurden unter Verwendung der murinen Mesotheliomzelllinie AB22 bzw. als Kontrolle an menschlichen gesunden Mesothelzelllinien MeT-5A durchgeführt. Die beiden Zelllinien wurden 24 Stunden lang mit steigenden Gd-Konzentrationen von PLGA-His und PLGA-CTRL inkubiert und nach 24 Stunden wurde die Menge an internalisiertem Gd und B mittels ICP-MS gemessen und auf die gesamten Zellproteine ​​normalisiert. Abbildung 2 zeigt, dass die Nanopartikelaufnahme durch AB22-Tumorzellen im Vergleich zur gesunden mesothelialen MeT-5A-Zelllinie insgesamt erhöht zu sein scheint. Darüber hinaus scheint die Aufnahme der mit Oligo-His beschichteten Nanopartikel in der Mesotheliomzelllinie AB22 im Vergleich zu den nicht konjugierten Nanopartikeln weiter verstärkt zu sein. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Vorhandensein von Histidin in PLGA-His keinen Einfluss auf die Aufnahme der NPs in gesunden Zellen hat, was darauf hindeutet, dass ein spezifischer pH-ausgelöster Mechanismus nur in bösartigen Zellen auftritt, wodurch diese NPs geeignet sind, gezielt auf diesen aggressiven Typ von Tumorzellen abzuzielen.

Die Aufnahmestudie wurde durchgeführt, indem die steigende Gd-Konzentration in PLGA-CTRL und PLGA-His auf AB22 und MeT-5A 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert wurde.

Aus den durch ICP-MS-Analyse erhaltenen Daten, durch Umrechnung von mg Proteinen in die Anzahl der Zellen (1 mg Protein entspricht 1,7 bzw. 6,3 Millionen Zellen für AB22 und MeT-5A) und der Annahme, dass im Fall von Epitheltumoren ( mit einem Durchmesser von 15–20 μm), einer Dichte von ca. 108 Zellen pro cm3 sind eine angemessene Zahl für diese Tumorgewebe.42 Es war möglich, die maximalen ppm an B zu berechnen, die in Zellen internalisiert wurden (siehe Tabelle 4).

Anschließend wurde ein T1-gewichtetes Bild von AB22- und MeT-5A-Zellen aufgenommen, die jeweils mit PLGA-CTRL oder PLGA-His inkubiert wurden, um zu beurteilen, ob die Konzentration des internalisierten AT101 für die Erzeugung einer nachweisbaren MRT-Signalintensitätssteigerung ausreichte bei 0,097 mM (Gd-Konzentration) und nach dem Waschen Zentrifugieren der Zellen am Boden von Glaskapillaren. Wie wir in Abb. 3 beobachten können, stimmt die Aufnahme der Nanopartikel mit den vorherigen Ergebnissen überein, was auf eine erhöhte Aufnahme von PLGA-His in Mesotheliomzellen im Vergleich zu gesunden Zellen und auch im Vergleich zu den mit PLGA-CTRL inkubierten Zellen hindeutet.

T1w-MRT-Bild von Glaskapillaren mit AB22- und MeT-5A-Zellpellets, inkubiert mit PLGA-CTRL (3 und 6), PLGA-His (2 und 5) und unbehandelten Kontrollzellen (1 und 4).

Zellen, die mit PLGA-Nanopartikeln inkubiert wurden, die AT101 einkapselten, wurden im Kernreaktor Triga Mark II der Universität Pavia mit thermischen Neutronen bestrahlt. Für diese Versuchsreihe wurden AB22- und MeT-5A-Zellen 24 Stunden lang unter drei verschiedenen Bedingungen vorinkubiert: (1) nur mit Medium (CTRL-Zellen), (2) mit PLGA-CTRL und (3) mit PLGA-His . PLGA-NPs wurden bei einer Konzentration inkubiert, die einer 0,097 mM Gd-Konzentration im Zellmedium entsprach. Die Zellen wurden an der thermischen Säule 15 Minuten lang mit einer Reaktorleistung von 30 kW bestrahlt. Wie in Abb. 4A gezeigt, ist eine starke zytotoxische Wirkung von BNCT auf AB22-Zellen deutlich erkennbar, wobei die Anzahl der Zellen 24 Stunden nach der Bestrahlung deutlich abnimmt. Tatsächlich starben nach der Bestrahlung im Vergleich zur bestrahlten Kontrollgruppe 30 % der mit PLGA-CTRL behandelten AB22-Zellen, und bei PLGA-His steigt der Prozentsatz auf 60 %. Im Gegensatz dazu zeigten MeT-5A-Zellen 24 Stunden nach der Bestrahlung keine signifikante Abnahme, was mit der geringeren NP-Aufnahme dieses Zelltyps übereinstimmt (wie in Abb. 2 und Tabelle 2 gezeigt). Diese Beobachtung wird durch die Ergebnisse gestützt, die mit dem klonogenen Assay erhalten wurden, der am Tag 18 nach der Bestrahlung durchgeführt wurde. Tatsächlich zeigt Abb. 4B, dass AB22 nach der Bestrahlung, insbesondere wenn es mit PLGA-His behandelt wird, keine Kolonien mehr bildet. Diese Ergebnisse deuten auf eine signifikante Abnahme der Fähigkeit von Mesotheliomzellen hin, sich wieder anzuheften, und bei Behandlung mit PLGA-NPs, insbesondere wirksam im Fall der PLGA-His-Verabreichung. Im Gegensatz dazu zeigen gesunde MeT-5A-Zellen im Vergleich zu bestrahlten unbehandelten Kontrollzellen nur eine leicht verringerte Koloniebildung.

(A) Normalisierte Zellzahl 24 Stunden nach der Neutronenbestrahlung, durchgeführt an AB22 und MeT-5A, die zuvor mit PLGA-CTRL oder PLGA-His behandelt wurden, und im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Die statistische Signifikanz wurde durch den Student-T-Test bestimmt (***P < 0,01); (B) klonogener Test, durchgeführt 18 Tage nach der Neutronenbestrahlung. Die Anzahl der Kolonien wurde mit der ImageJ-Software berechnet. Der Prozentsatz wurde berechnet, indem die bestrahlten Kontrollzellen auf 100 % gesetzt wurden.

Mesotheliom ist ein aggressiver Krebs, der mit Asbestexposition einhergeht. Obwohl Asbest in mehreren Ländern verboten ist, wird aufgrund des hohen Asbestverbrauchs in diesem Jahrhundert eine Mesotheliom-Epidemie in Ländern mit mittlerem Einkommen vorhergesagt. Patienten, die von dieser Krankheit betroffen sind, haben oft eine schlechte Prognose, da es an sinnvollen und wirksamen Therapien mangelt, da die konventionelle Chemotherapie diesen Krebssubtyp nicht wirksam bekämpfen und beseitigen kann43. Obwohl neuere Arbeiten bedeutende Behandlungsmöglichkeiten gefunden und genetische und pathophysiologische Schwachstellen identifiziert haben, bleibt das Mesotheliom eine der Krebsarten mit der niedrigsten Überlebensrate. Daher sollten wir in diesem Artikel die Möglichkeit eines innovativen Ansatzes aufzeigen, der auf der Bor-Neutroneneinfangtherapie mit einer theranostischen Verbindung basiert, die durch PLGA-Nanopartikel bereitgestellt wird. Wir haben PLGA-Nanopartikel mit Polyhistidinketten entwickelt und charakterisiert, die in der Lage sind, die theranostische Verbindung AT101 effektiv zurückzuhalten und gezielt an die Tumorzellen abzugeben und so die Vorteile dieser gezielten Strahlentherapie voll auszunutzen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass diese Nanopartikel bevorzugt von Mesotheliomen aufgenommen werden als von gesunden Mesothelzellen, was die Möglichkeit eines gezielten therapeutischen Ansatzes zur Heilung dieser schrecklichen Krankheit nahelegt. Folglich wurden AB22-Mesotheliomzellen durch die Neutronenbestrahlung stark beeinträchtigt und führten zu irreversiblen Schäden, wohingegen ein hoher Prozentsatz der gesunden Zellen von der gleichen Behandlung verschont blieb, wie auch der klonogene Test zeigte. Daher schlagen wir BNCT als mögliche alternative Therapiestrategie zur Behandlung von Mesotheliomen vor.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und analysierten Datensätze werden auf Anfrage weitergegeben. Anfragen sind an den entsprechenden Autor zu richten.

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Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen führte, wurde vom AIRC im Rahmen von IG 2019 – ID gefördert. 23267-Projekt (PI Geninatti Crich Simonetta) und vom italienischen Nationalinstitut für Kernphysik-Projekt: Enter_BNCT und dem italienischen Ministerium für Universität und Forschung (MUR) für die jährliche FOE-Finanzierung an den Euro-BioImaging Multi-Modal Molecular Imaging Italian Node (MMMI).

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Nicoletta Protti & Saverio Altieri

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Nicoletta Protti & Saverio Altieri

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Konzeptualisierung: SGC, AD, JS; Methodik: SGC, AD, JS, DA, SA; Untersuchung: JS, DA, AL, PR, SP, RS, NP, BV; Analyse: JS, DA, VB, AL Schreiben – Originalentwurf: SGC, JS, DA; Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten: AD, PR, AL, SP, SGC, SA, NP; Finanzierungseinwerbung: SGC, AD, SA, NP

Korrespondenz mit Annamaria Deagostino oder Simonetta Geninatti Crich.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 13. November 2022

Angenommen: 04. Januar 2023

Veröffentlicht: 12. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27625-0

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