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Jun 05, 2023

Ca2+-Ausfluss erleichtert durch Co

Band Kommunikationsbiologie

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 573 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Ca2+ ist ein wichtiger Signalbotenstoff. In Mikroorganismen, Pilzen und Pflanzen spielen H+/Ca2+-Antiporter (CAX) bekanntermaßen eine Schlüsselrolle bei der Homöostase von intrazellulärem Ca2+, indem sie dessen Ausfluss durch die Zellmembran katalysieren. Hier zeigen wir, dass das bakterielle CAX-Homolog YfkE Ca2+ in zwei unterschiedlichen Modi transportiert: einem H+/Ca2+-Austauschmodus mit niedrigem Fluss und einem Modus mit hohem Fluss, in dem Ca2+ und Phosphationen im Austausch gemeinsam transportiert werden (1:1). H+. Die Kopplung mit Phosphat beschleunigt die Ca2+-Efflux-Aktivität von YfkE erheblich. Unsere Studien zeigen, dass Ca2+ und Phosphat in einem zentralen Translokationsweg an benachbarte Stellen binden und zu mechanistischen Erkenntnissen führen, die erklären, wie dieses CAX seine konservierten Alpha-Repeat-Motive verändert, um Phosphat als spezifisches „Transport-Chaperon“ für die Ca2+-Translokation zu übernehmen. Dieser Befund deckt einen Co-Transportmechanismus innerhalb der CAX-Familie auf, der darauf hinweist, dass diese Proteinklasse zur zellulären Homöostase von Ca2+ und Phosphat beiträgt.

Calciumionen gehören zu den am häufigsten vorkommenden Metallionen in der Natur und sind für viele wichtige Funktionen in Zellen von entscheidender Bedeutung, wo Ca2+ als vielseitiger Botenstoff dient1,2. Ca2+-Signale werden typischerweise durch den Ca2+-Einstrom in das Zytoplasma über selektive Membrankanäle initiiert und durch den Ca2+-Ausstrom aus intrazellulären Organellen wie dem endoplasmatischen Retikulum weiter verstärkt. Anhaltend hohe zytosolische Ca2+-Werte sind jedoch tödlich. Calcium-Kationen-Antiporter (CaCA) sind der Schlüssel zur Wiederherstellung der Ca2+-Homöostase. Diese Familie von Membrantransportern, zu der H+/Ca2+-Antiporter (CAX) und Na+/Ca2+-Austauscher (NCX) gehören, sequestriert und exportiert Ca2+ aktiv aus dem Zytosol, angetrieben durch den Zufluss von H+ oder Na+ entlang der elektrochemischen Transmembrangradienten3,4.

CAXs sind in Bakterien, Pilzen und Pflanzen allgegenwärtig3. Beispielsweise wurden drei CAX-Homologe, bekannt als CAX1-3, in Arabidopsis und mehr als zwanzig weitere in Apfelbäumen identifiziert3,5. In Pflanzenzellen sind CAX-Proteine ​​sowohl im Plasma als auch in den Tonoplastenmembranen vorhanden und erleichtern die Bewegung von zytosolischem Ca2+ entweder aus der Zelle heraus oder zurück in die sauren Vakuolen als Reaktion auf verschiedene Reize, einschließlich Kälte, Salzgehalt und pH-Änderungen des Bodens5,6, 7,8. CAX-Homologe sind auch in Mikroorganismen allgegenwärtig, ihre physiologischen Rollen erfordern jedoch weitere Untersuchungen. Ca2+ ist an einer Vielzahl bakterieller Prozesse beteiligt, darunter Chemotaxis, Zellteilung und Sporulation;9 Die Ca2+-Signalübertragung ist auch an bakteriellen Infektionen und Wirt-Pathogen-Interaktionen beteiligt10. CAX-Proteine ​​dürften bei diesen Prozessen eine zentrale Rolle spielen, da sie offenbar die wichtigsten Ca2+-Effluxsysteme in Bakterien sind. Daher wird die Aufklärung des Transportmechanismus von CAX dazu beitragen, zu verstehen, wie diese Organismen als Reaktion auf Ca2+-Störungen und -Signale das Ca2+-Gleichgewicht aufrechterhalten.

Strukturell scheinen alle CAX-Proteine ​​eine gemeinsame Grundarchitektur zu haben, die aus elf Transmembran(TM)-Helices besteht. Zwei konservierte Sequenzmotive, die als α-Repeats bezeichnet werden, finden sich in den Helices TM2-3 und TM7-8 und scheinen Stellen für die H+- und Ca2+-Erkennung bereitzustellen. Röntgenstrukturen haben kürzlich damit begonnen, die molekulare Grundlage für den Mechanismus dieser Klasse von Antiportern aufzudecken, nämlich die von YfkE aus Bacillus subtilis, VCX1 aus Saccharomyces cerevisiae und CAX_Af aus Archaeoglobus fulgidus11,12,13. Diese Strukturen legen einen Mechanismus nahe, bei dem die Helices TM2-3 und TM7-8 unterschiedliche Anordnungen annehmen, die abwechselnd Erkennungsstellen für H+ und Ca2+ auf beiden Seiten der Membran freilegen. Diese drei Strukturen erfassen jedoch einen ähnlichen Zustand im alternierenden Zugangsmechanismus, nämlich einen, der nach innen (d. h. zum Zytosol hin) offen ist, in dem zwei konservierte Glutamatreste, die für die H+/Ca2+-Austauschaktivität wichtig sind, benachbart in einem zentralen Ion lokalisiert sind -Bindungsseite. Diese beiden Carboxylatreste koordinieren ein Ca2+-Ion in der VCX1-Struktur11. Ob die Strukturen von YfkE und CAX_Af einen unligandierten Zustand oder einen an H+ gebundenen Zustand einfangen, war nicht sofort ersichtlich, obwohl die beiden Carboxylatreste (E72 und E255 in YfkE) im Vergleich zum Ca2+-gebundenen Zustand von VCX1 unterschiedliche Konformationen annehmen. Kürzlich haben unsere Studien für YfkE auch ergeben, dass sein alternierender Zugriffsmechanismus allosterisch durch die Bindung von Ca2+ an einen intrazellulären Ca2+-Minisensor12 reguliert wird.

Hier enthüllen wir eine Art Ca2+-Transportmechanismus für YfkE und möglicherweise auch für andere Mitglieder der CAX-Familie. Wir zeigen, dass YfkE einen Transportmodus aufweist, bei dem Ca2+ und anorganisches Phosphat (Pi) im Verhältnis 1:1 im Austausch gegen H+ co-transloziert werden. Die Kopplung an Pi wandelt YfkE von einem Antiporter mit niedrigem Fluss in einen Antiporter mit hohem Fluss um. Um Einblicke in diesen Ca2+-Pi-Kotransportmechanismus zu gewinnen, nutzen wir mehrere biochemische und biophysikalische Ansätze zusammen mit Computersimulationen und experimenteller molekularer Modellierung. Unsere Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass Ca2+ und Pi an eine gemeinsame Erkennungsstelle im Inneren des Transporters binden, zu der auch E72 und E255 sowie andere polare Reste in der Nähe gehören. E72 und E255 können jedoch stattdessen H+ binden, was die Fähigkeit von YfkE erklärt, den H+-Gradienten zu nutzen, um den Ca2+- und Pi-Transport anzutreiben. Unsere Ergebnisse ermöglichen es uns auch zu erklären, warum die Translokation von Pi-Anionen die Ca2+/H+-Austauschreaktion beschleunigt.

Pi ist ein wichtiger Nährstoff und kommt in den Zellen reichlich für die Synthese von Nukleotiden, Energie und Phospholipiden vor. Wir liefern ein Beispiel dafür, dass ein Transporterprotein gleichzeitig die Membrantranslokation von Ca2+ und Pi erleichtert. Unsere Ergebnisse offenbaren nicht nur einen einzigartigen Transportmodus innerhalb der CAX-Familie, sondern legen auch seine physiologische Rolle bei der Homöostase von Ca2+ und Phosphat in Zellen nahe.

Um mit der Charakterisierung von YfkE zu beginnen, haben wir seine Ca2+-Transportaktivität mithilfe von Inside-Out-Vesikeln gemessen, nachdem durch Zugabe von NADH ein H+-Gradient nach außen aufgebaut wurde, der das H+-Pumpen in die Vesikel durch die Elektronentransportkette aktiviert. Wie erwartet zeigte der resultierende Zeitverlauf, dass Ca2+ in die YfkE-Vesikel transportiert wurde (Abb. 1a). Die beobachtete Transportaktivität passte gut zum Michaelis-Menten-Kinetikmodell und ergab KM = 69 µM und Vmax = 4,2 µmol/min/g (Abb. 1b). Bemerkenswerterweise beschleunigte die Zugabe von 5 mM anorganischem Phosphat (Pi) zur äußeren Lösung (dh der intrazellulären Seite des Vesikels) die Ca2+-Transportaktivität von YfkE stark um das Achtfache (Abb. 1a). Insbesondere ergab die kinetische Analyse KM = 198,7 µM und Vmax = 33,3 µmol/min/g (Abb. 1b). Im Gegensatz dazu beobachteten wir keinen Effekt für Pi-Analoga wie Nitrat, Sulfat, Arsenat und Vanadat (ergänzende Abbildung 1) oder für ATP (ergänzende Abbildung 2), was darauf hindeutet, dass die Beschleunigung des Ca2+-Transports durch YfkE spezifisch durch Pi vermittelt wird . Es ist erwähnenswert, dass Ca(H2PO4)2, die Hauptform von Calciumphosphatverbindungen bei neutralem pH-Wert, in wässrigen Lösungen gut löslich ist. Konsistent beobachteten wir keine Ca2+-Akkumulation in Kontrollvesikeln ohne YfkE, selbst wenn Pi vorhanden war (Abb. 1a), was ausschließt, dass Ca2+ und Pi einen Niederschlag bilden könnten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass YfkE die Verfügbarkeit von zytosolischem Pi nutzt, um seine H+/Ca2+-Antiport-Aktivität hochzuregulieren.

a 45Ca2+-Transportassays (+/− Pi), gemessen unter Verwendung von Inside-Out-Vesikeln. Die Vesikel wurden mit 5 mM Pi gemischt, bevor 0,5 mM 45CaCl2 hinzugefügt wurde, um die Reaktionen bei Raumtemperatur auszulösen. Als Kontrolle dienten leere Vesikel. b Kinetische Analyse des Ca2+-Transports von YfkE (+/−5 mM Pi). Die Daten wurden mit den jeweiligen Kontrollvesikeln subtrahiert und dann mit GraphPad 9 in die Michalis-Menten-Kinetik eingepasst. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar (n = 3).

Diese Beobachtungen führten uns zu der Hypothese, dass Pi die Aktivität von YfkE stimuliert, weil Ca2+ und Pi gemeinsam transportiert werden. Obwohl unseres Wissens kein Pi-Transport für andere CAX-Antiporter beobachtet wurde, wurde für andere Proteinfamilien über den gleichzeitigen Transport eines Kations und Pi berichtet. Beispielsweise nutzt der Na+/Pi-Symporter SLC34 einen Na+-Gradienten, um die Pi-Aufnahme voranzutreiben14. Um diese Hypothese zu testen, haben wir den Pi-Transport unter Verwendung von 32P-Phosphat-Kalium als Substrat gemessen. Wie in Abb. 2a zu sehen ist, wurde Pi zeitabhängig in die YfkE-Vesikel importiert. In Übereinstimmung mit den Ca2+-Transporttests (Abb. 1a) wurde die Pi-Aufnahme nur in Gegenwart von Ca2+ (+0,5 mM) beobachtet und kein Zustrom festgestellt, wenn Ca2+ fehlte (Abb. 2a). Ebenso wurde in Kontrollvesikeln ohne YfkE keine Pi-Aufnahme festgestellt, unabhängig davon, ob in Gegenwart oder Abwesenheit von Ca2+ (Abb. 2a). Diese Ergebnisse ließen die Hypothese aufkommen, dass YfkE den Co-Transport von Ca2+ und Pi katalysiert.

a Zeitlicher Verlauf des Pi-Transports von YfkE, gemessen unter Verwendung von Inside-Out-Vesikeln (+/− 0,5 mM Ca2+). Der Reaktion wurden 5 mM 32Pi-Substrat zugesetzt. Als Kontrolle dienten leere Vesikel. b Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Bild des gereinigten YfkE-Proteins. c Bewertung der Orientierung von YfkE in mit Thrombin behandelten Proteoliposomen. Der Immunblot wurde unter Verwendung von Anti-His-Antikörpern entwickelt. d 32Pi-Transportassays wurden unter Verwendung rekonstituierter Proteoliposomen gemessen und zeigten, dass YfkE Pi in Gegenwart von 0,5 mM Ca2+ importiert, nicht in Gegenwart von 2 mM EDTA. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar (n = 3).

Die oben beschriebenen Vesikeltests zeigen, dass YfkE für den gemeinsamen Transport von Ca2+ und Pi erforderlich ist, da diese Aktivität auch in Kontrollvesikeln ohne YfkE nicht beobachtet wurde (Abb. 1a und 2a). Um sicherzustellen, dass YfkE allein diese Aktivität vermittelt, ohne dass andere Ionentransportproteine ​​beteiligt sind, haben wir YfkE gereinigt und in Proteoliposomen rekonstituiert (Abb. 2b, c und ergänzende Abb. 3). Die Ausrichtung von YfkE in diesen Proteoliposomen ist wahrscheinlich mit der rechten Seite nach außen gerichtet, was durch begrenzte Proteolyse beurteilt wird, da Thrombin den N-terminalen His-Tag von YfkE auf der intrazellulären Oberfläche entfernen würde (Abb. 2c und ergänzende Abb. 3). Um die Transportreaktion zu starten, wurde ein pH-Gradient nach außen durch Verdünnen der Proteoliposomen (pH 7,4) in einem Puffer mit höherem pH-Wert (pH 8) hergestellt und die H+-gekoppelte Pi-Aufnahme wurde unter Verwendung von P32-Phosphat gemessen. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass YfkE in Gegenwart von 0,5 mM Ca2+ Pi in die Proteoliposomen importiert, jedoch nicht in Abwesenheit von Ca2+ (+2 mM EDTA) (Abb. 2d). Diese Ergebnisse bestätigen unsere Vesikeltests und bestätigen weiter, dass YfkE allein Ca2+/Pi im Austausch gegen H+ durch die Membran transportiert.

In Übereinstimmung mit dem Co-Transportmechanismus wurde die Pi-Transportaktivität von YfkE WT deutlich verringert, als die Ca2+-Konzentration von 0,5 mM (Abb. 2a) auf 0,1 mM Ca2+ (Abb. 3a) reduziert wurde. Ein Vergleich der beobachteten Transportraten für jede Spezies in denselben Vesikeln zeigt, dass die Stöchiometrie dieser Kopplung 1 Ca2+:1 Pi beträgt (Abb. 3b, c). Im Vergleich zu Ca2+ ist die scheinbare Bindungsaffinität von Pi jedoch viel schwächer (KM = 4,9 mM), basierend auf der Analyse der Transportkinetik (Abb. 3d und Tabelle 1). Die Pi-Substratbindung wurde auch mithilfe eines radioaktiv markierten 32Pi-Bindungstests nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigten, dass Pi an das YfkE-WT-Protein bindet, diese jedoch durch die Mutation von E72A und E255A gestört wurde (Abb. 3e). Die Pi-Bindung wurde weiter durch isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) charakterisiert und ergab eine Bindungsaffinität von ~ 1 mM (Abb. 3f), entsprechend dem KM-Wert, der aus der Transportkinetikanalyse ermittelt wurde (Abb. 3d). Zusammen mit den oben genannten Transporttests bestätigen alle diese In-vitro-Charakterisierungen insgesamt, dass Pi tatsächlich ein Co-Transportsubstrat von YfkE ist.

Ein 32Pi-Transportassay wurde unter Verwendung von Inside-Out-Vesikeln gemessen und zeigte im Gegensatz zu WT keine Aktivität von E72A (rote Quadrate) und E255A. Die Tests wurden in Gegenwart von 0,1 mM Ca2+ durchgeführt. b Ca2+- oder Pi-Transportraten, gemessen in denselben YfkE-Vesikeln zu angegebenen Zeitpunkten. c Stöchiometrie von Ca2+ vs. Pi durch Vergleich ihrer Transportraten (b). d Pi-Transportkinetik von YfkE (+0,1 mM Ca2+) bei den angegebenen zytosolischen pH-Bedingungen. Die Daten wurden mit (-)-Kontrolle subtrahiert und dann in die Michalis-Menten-Kinetik eingepasst, um KM und Vmax mit GraphPad 9 zu berechnen. e Radioaktiv markierter 32Pi-Bindungstest unter Verwendung des gereinigten YfkE-Proteins Wildtyp, E72A und E255A, immobilisiert auf Ni-NTA-Kügelchen . f ITC-Analyse der Pi-Bindung an YfkE. 10 mM Pi wurden in eine YfkE-Proteinlösung titriert. Die Anpassung des kinetischen Modells mithilfe der Origin-Software ergibt eine Bindungsaffinität von 0,93 ± 0,36 mM. g Pi-Transportkinetikparameter (KM und Vmax) von YfkE, gemessen bei dem angegebenen pH-Wert. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar (n = 3 für (a, d, e, g); n = 4 für (b, c)).

Zusammenfassend lassen diese Daten den Schluss zu, dass YfkE den Ca2+-Ausfluss über zwei verschiedene Modi oder Mechanismen katalysiert: einen langsamen Modus, wenn Pi fehlt oder weitgehend nicht verfügbar ist; und ein schneller Modus, wenn intrazelluläres Pi ausreichend vorhanden ist, was den gemeinsamen Transport von Ca2+ und Pi beinhaltet. Wichtig ist, dass in beiden Fällen der Ca2+-Transport gemäß dem alternierenden Zugangsmodell den Gegentransport von H+ entlang seines elektrochemischen Gradienten erfordert. Dementsprechend wurde durch die Zugabe des H+-Ionophors Carbonylcyanid m-Chlorphenylhydrazon (CCCP) zu unseren Transporttests die Ca2+-Aufnahme in die Inside-Out-Vesikel in Abwesenheit oder Anwesenheit von Pi vollständig aufgehoben (ergänzende Abbildung 2).

In Lösung kann Pi je nach pH-Wert in unterschiedlichen Ionisationszuständen vorliegen. Insbesondere das Gleichgewicht zwischen monoanionischem H2PO41− und dianionischem HPO42− weist einen pKa-Wert von 7,2 auf. Um zu beurteilen, welche Pi-Art am wahrscheinlichsten mit Ca2+ durch YfkE gemeinsam transportiert wird, haben wir die Pi-Aufnahme in von innen nach außen gerichtete Vesikel gemessen und dabei den äußeren pH-Wert variiert, d. h. die Größe des nach außen gerichteten H+-Gradienten, aber auch den Pi Ionisationsgleichgewichte. Wie erwartet beschleunigte sich die Pi-Aufnahme, als der äußere pH-Wert von 6,5 auf 7,5 erhöht wurde, was wahrscheinlich auf eine stärkere treibende Kraft durch den bergab gerichteten H+-Ausfluss zurückzuführen ist (Abb. 3g). Bei höheren pH-Werten wurde der Transport jedoch deutlich und allmählich gehemmt, was darauf hindeutet, dass YfkE kein dianionisches Pi, sondern monoanionisches H2PO41− erkennen kann.

Im Gegensatz zu Ca2+ gibt es keine klare Definition eines prototypischen Pi-Bindungsmotivs in Proteinstrukturen. Es ist jedoch bekannt, dass positiv geladene Reste (Arginin und Lysin) und polare Reste wie Threonin, Serin und Histidin einen positiven Beitrag zur Pi-Bindung leisten15. Die Ca2+-Erkennungsstelle im Inneren von YfkE, gebildet durch E72, E255 und umgebende polare Reste, ist die einzige Region, die für die Pi-Erkennung in der Transmembrandomäne des Proteins geeignet ist (ergänzende Abbildung 4a)12. Versuche, einen alternativen Weg für die Pi-Translokation zu identifizieren, der beispielsweise durch R4 und R46, zwei positiv geladene Reste auf der intrazellulären Proteinoberfläche, vermittelt wird, führten zu keiner Veränderung der Pi-Transportaktivität (ergänzende Abbildungen 4b, c und Tabelle 1). Wie oben erwähnt, zeigen radioaktiv markierte Pi-Bindungstests, dass die Mutation der beiden Reste, von denen bekannt ist, dass sie Ca2+ koordinieren, auch die Pi-Bindung störte (Abb. 3e), was darauf hindeutet, dass diese beiden Ionen in unmittelbarer Nähe zueinander an einer gemeinsamen Erkennungsstelle innerhalb des Proteins binden.

Um diese Hypothese weiter zu testen, haben wir einen Assay entwickelt, der auf dem Lumineszenzresonanzenergietransfer (LRET) basiert. LRET-Messungen berichten über Veränderungen im Abstand zwischen einem fluoreszierenden Donor und seinem Akzeptor, die sich in Lumineszenzsignalen unterschiedlicher Lebensdauer manifestieren. Mit diesem Ansatz wollten wir herausfinden, ob die Erkennung von Ca2+ und Pi vergleichbare Konformationsänderungen bei YfkE hervorruft. Wie die oben beschriebenen Funktionstests wurden diese Messungen in Inside-Out-Vesikeln durchgeführt, um das Protein in seiner natürlichen Membranumgebung zu untersuchen (Einzelheiten siehe „Methoden“). Insbesondere markierten wir die Positionen G56 (intrazelluläre TM1-2-Schleife) und C3 (Aminoterminus) mit Terbiumchelat bzw. Atto-465 unter Verwendung thiolreaktiver Chemie (Abb. 4a). Basierend auf den LRET-Ergebnissen beträgt der Abstand zwischen Donor und Akzeptor in Abwesenheit eines Substrats 25,5 ± 0,2 Å (Abb. 4b). Die Zugabe von entweder 0,5 mM Ca2+ oder 5 mM Pi zu den Vesikeln vergrößerte den Abstand in ähnlicher Weise auf 26,9 ± 0,3 Å. Um dieses Ergebnis zu überprüfen, haben wir den Terbium-Chelat-Donor an der Position S202 (in TM6) eingeführt, während der Atto-465-Akzeptor in C3 belassen wurde (Abb. 4d). Wie für G56 beobachtet, erhöhte die Zugabe von Ca2+ oder Pi den Abstand zwischen Donor und Akzeptor in ähnlicher Weise von 26,3 ± 0,1 Å auf 27,7 ± 0,2 oder 28 ± 0,2 Å (Abb. 4e). Wichtig ist, dass sowohl G56C- als auch S202C-Mutanten die Ca2+-Aufnahmeaktivität in Gegenwart von Pi beibehielten (ergänzende Abbildung 5). Daher spiegeln die durch LRET erfassten Abstandsänderungen wahrscheinlich Proteinkonformationsänderungen wider, die durch die Substratbindung hervorgerufen werden. Zugegebenermaßen sind diese Änderungen aufgrund einer suboptimalen Position von Donor und Akzeptor geringfügig, und daher ist es nicht möglich, zu erkennen, welche Proteinbewegungen durch diese Daten repräsentiert werden. Diese Unterschiede sind jedoch statistisch signifikant und werden spezifisch durch Ca2+ oder Pi induziert. Tatsächlich wurden bei Zugabe von 5 mM Sulfat, einem Pi-Analogon, keine Veränderungen beobachtet (Abb. 4c, f). Zusammenfassend stützen die LRET-Messungen unsere Hypothese, dass sowohl Ca2+ als auch Pi auf eine gemeinsame Erkennungsstelle innerhalb des Proteins zugreifen.

a, d Thema des LRET-Versuchsdesigns zur Messung des Abstands (rote gestrichelte Linie) zwischen dem Donor (blaue Kugel) am N-terminalen C3 und dem Rezeptor (rote Kugel) bei G56C von TM1 (orange) (a) oder S202C von TM6 ( Magenta) (d). Wegbildende Helices sind grün gefärbt; Durch die Thrombinspaltung (dargestellt als Schere) wird der Spender entfernt, um den Hintergrund der Rohmembran zu berechnen. Blaue Pfeile zeigen Helix-Konformationsänderungen in der Membran an. b, c, e, f LRET-Spuren nach Subtraktion des jeweiligen Hintergrunds: Apo-Form (schwarz), +0,5 mM Ca2+ (blau), +5 mM Pi (rot) und 5 mM Sulfat (grün). b, c G56C; e, f S202C.

Um einen strukturellen Kontext für diese biochemischen und biophysikalischen Messungen bereitzustellen, griffen wir auf molekulare Modellierung zurück. Insbesondere versuchten wir, ein hypothetisches Modell zu konstruieren, das erklären könnte, wie YfkE sowohl Ca2+ als auch Pi auf eine Weise erkennt, die zu einer Konkurrenz mit H+ führt, wie es für einen gekoppelten Ionen-Antiporter üblich ist. Der erste Schritt in diesem Prozess bestand darin, festzustellen, ob die bestehende Struktur des nach innen gerichteten YfkE12 einen H+-gebundenen Zustand einfängt. Wenn das der Fall ist, sind wir zu dem Schluss gekommen, dass diese experimentelle Struktur eine gute Grundlage für die Modellierung des an Ca2+ und Pi gebundenen Zustands bieten würde; Tatsächlich zeigen verfügbare Strukturdaten für Membran-Antiporter, dass alternative substratgebundene Formen desselben Funktionszustands sich hauptsächlich in der Konfiguration der Seitenketten, die die Substratbindungsstellen bilden, unterscheiden, ohne dass sich das Proteinrückgrat wesentlich verändert.

Zu diesem Zweck führten wir eine Reihe von Molekulardynamiksimulationen für alle Atome durch, um die Wahrscheinlichkeit der Protonierung ausgewählter Seitenketten im Inneren des Transporters zu quantifizieren (ergänzende Abbildung 6). Insbesondere konzentrierten wir uns auf E72, E255 und H256, die drei protonierbaren Reste im zentralen Weg innerhalb der α-Wiederholungen (Abb. 5a). Es wurde zuvor vorhergesagt, dass H256 an der H+-Bindung beteiligt ist, da es in H+-gekoppelten CAXs konserviert ist, nicht jedoch in Na+-gekoppelten NCXs12. Als Negativkontrollen haben wir auch E233 und H226 untersucht, die auf der Proteinoberfläche exponiert sind und daher bei einem bestimmten pH-Wert voraussichtlich nicht wesentlich von ihren inhärenten Protonierungsneigungen in Lösung abweichen. Wie in Tabelle 2 zusammengefasst, deuten unsere Ergebnisse stark darauf hin, dass sowohl E72 als auch E255 gleichzeitig in der vorhandenen nach innen gerichteten Struktur von YfkE protoniert werden. Wenn man protonierte und deprotonierte Zustände einzeln vergleicht, wird am deutlichsten, dass der erstere in der spezifischen Geometrie der Kristallstruktur im Vergleich zu dem, was dieser Art von Seitenkette in Lösung innewohnt, sehr stark bevorzugt ist. (Mit anderen Worten, der „scheinbare pKa“ von E72 und E255 in dieser spezifischen Konformation ist stark nach oben verschoben.) Diese Neigung ist bei E72 erheblich größer als bei E255, was darauf hindeutet, dass E72 die letzte Stelle ist, die im nach innen gerichteten Zustand deprotoniert . Wenn E255 neu bewertet wird, während E72 protoniert (dh ungeladen) ist, verringert sich logischerweise die Protonierungswahrscheinlichkeit von E255, sie bleibt jedoch stark nach oben verschoben. Im Gegensatz dazu ist die berechnete Protonierungsneigung für den Oberflächenrest E233 der von freiem Glutamat in Lösung sehr ähnlich, unabhängig davon, ob E72 und E255 als protoniert angenommen werden oder nicht. Dieses Ergebnis entspricht den Erwartungen für einen nicht funktionsfähigen Standort und bestätigt die Gültigkeit der hier verwendeten Simulationsmethode zur Bewertung der relativen Protonierungsenergetik.

ein Vergleich zwischen den Strukturen von protoniertem YfkE (cyan) und Ca2+-gebundenem VCX1 (orange), der ihre Konformationsänderungen (schwarze Pfeile) von drei titrierbaren Resten (Stäbchen) im Translokationsweg zeigt. Die TMs 2 und 7 werden als Cartoons dargestellt. In VCX1 interagiert E106 mit Ca2+ (grüne Kugel) über Wasser (rote Kugel) durch H-Brücken (schwarze gestrichelte Linien). Die Reste von VCX1 sind unterstrichen gekennzeichnet. b Kinetische Analyse des 45Ca2+-Transports, gemessen unter Verwendung von Inside-Out-Vesikeln, die im Gegensatz zu WT keine Aktivität von E72Q und E255Q zeigt. Die Daten wurden mit (-) Kontrollvesikeln subtrahiert. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar (n = 3). c–e Isotherme Titrationskurven von Ca2+ in einer Proteinlösung von YfkE WT (c), E255Q (d) und E72Q (e). Die Datenanpassung wurde mit der Software Origin durchgeführt.

Im Gegensatz zu unseren Ergebnissen für E72 und E255 zeigt die Untersuchung von H256 mit dem gleichen Ansatz, dass diese Seitenkette in der von der Kristallstruktur erfassten Konformation von YfkE deprotoniert ist (Tabelle 2). Selbst wenn man davon ausgeht, dass E72 und E255 negativ geladen sind, was im Prinzip eine positive Ladung bei H256 begünstigen würde, erkennen wir keine signifikante Verschiebung der Protonierungswahrscheinlichkeit von H256 im Vergleich zu einem Histidin-Analogon in Lösung oder im Vergleich zu H226, das exponiert ist auf der Proteinoberfläche. Wenn man davon ausgeht, dass E72 und E255 protoniert sind, ist die Protonierung von H256 noch unwahrscheinlicher; tatsächlich ist deprotoniertes H256 eindeutig bevorzugt (dh sein „scheinbarer pKa“ ist nach unten verschoben).

Zusammenfassend zeigt diese Analyse, dass die nach innen gerichtete Kristallstruktur von YfkE einen substratgebundenen Zustand einfängt, nämlich mit zwei H+-Bindungen an den Stellen E72 und E255. H256 bindet jedoch nicht gleichzeitig ein drittes H+, was darauf hindeutet, dass die Antiport-Stöchiometrie von YfkE 1Ca2+:2H+ sein könnte. Diese Ergebnisse stimmen mit der oben erwähnten Beobachtung überein, dass die Alaninmutation von E72 oder E255 den H+-gesteuerten Ca2+-Transport in experimentellen Tests aufhebt12. Im Gegensatz dazu ist der Effekt der Alaninmutation von H256 zwar signifikant, aber vergleichbar mit dem der Mutation anderer nicht protonierbarer polarer Seitenketten in der Nähe von H+-Bindungsstellen, wie z. B. N69A oder Q281A12.

Wie bereits erwähnt, wurde bei Strukturstudien eines CAX-Proteins aus Hefe, VCX1, Berichten zufolge ein gebundenes Ca2+-Ion nachgewiesen11. Die Bindungsstelle wird durch zwei saure Reste gebildet, E109 und E305, die E72 bzw. E255 in YfkE entsprechen. Es scheint daher klar, dass 2 H+ mit 1 Ca2+ um die Bindung an diese Stelle konkurrieren. Allerdings legen die unterschiedlichen Protonierungsneigungen von E72 und E255 nahe, dass sie sich in diesem Konkurrenzmechanismus nicht ähneln. Tatsächlich weist die Struktur von VCX1 auch auf die unterschiedliche Rolle dieser beiden Carboxylatreste bei der Ca2+-Bindung hin, d. h. E305 (E255 in YfkE) koordiniert Ca2+ direkt, während E109 (E72 in YfkE) indirekt über drei Wassermoleküle mit dem Ion interagiert ( Abb. 5a)11. Um Einblicke in ihre spezifischen Rollen bei der Ca2+/H+-Bindung zu gewinnen, haben wir E72 und E255 zu Glutamin mutiert, wodurch die Deprotonierung eliminiert wird, während die Ca2+-Bindung prinzipiell möglich bleibt. Wie erwartet wurde der Ca2+-Transport durch die E72Q- oder E255Q-Mutation vollständig aufgehoben, da die Deprotonierung beider Carboxylatseitenketten erforderlich ist, um den Antiport-Zyklus zu schließen (Abb. 5b). Die Untersuchung dieser beiden mutierten Proteine ​​mittels ITC bestätigte jedoch, dass sie unterschiedliche Rollen in Bezug auf die H+/Ca2+-Bindung spielen. Die Ca2+-Titration auf WT-YfkE ergab eine Bindungsaffinität von 0,46 ± 0,02 µM (Abb. 5c). Für E255Q wurde innerhalb des Titrationsbereichs keine Sättigung beobachtet, was darauf hinweist, dass die E255-Carboxylatgruppe für die Ca2+-Bindung erforderlich ist (Abb. 5d). Im krassen Gegensatz dazu scheint das Carboxylat in E72 entbehrlich zu sein, da E72Q die Ca2+-Bindung nicht beeinträchtigt. Stattdessen erhöht die Mutation die scheinbare Ca2+-Bindungsaffinität um das Dreifache (Kd = 0,14 ± 0,001 µM) im Vergleich zur WT (Abb. 5e). Zusammengenommen legen rechnerische und experimentelle Ergebnisse nahe, dass der erste Schritt im Mechanismus, durch den YfkE Ca2+ im nach innen gerichteten Zustand erkennt, die Deprotonierung von E255 ist; Dieser Schritt ist für die Ca2+-Bindung notwendig und ausreichend. Die Deprotonierung von E72 würde anschließend erfolgen und wahrscheinlich von einem größeren Konformationsübergang in den nach außen gerichteten Zustand gefolgt werden.

Mehrere Belege belegen, dass sowohl Ca2+ als auch Pi im zentralen Translokationsweg nebeneinander gebunden sind: Erstens hebt eine Mutation der an der Ca2+-Bindung beteiligten Reste, d. h. E72 und E255, nicht nur den Pi-Transport auf (Abb. 3a), sondern auch die Pi-Bindung ( Abb. 3e); Zweitens induzieren Ca2+ und Pi ähnliche Konformationsänderungen, wie mit LRET gemessen (Abb. 4); und drittens verändert der Pi-Co-Transport den KM für Ca2+ (Abb. 1b). In der Struktur von YfkE befinden sich mehrere polare Reste, darunter N69, N99, Q252, Q281 und H256, neben E72 und E255 in der Nähe der Transportbindungsstelle12. Obwohl diese polaren Reste in der CAX-Familie konserviert sind (ergänzende Abbildung 7), haben sie keine direkte Wechselwirkung mit Ca2+ in der Ca2+-gebundenen Zustandsstruktur von VCX111. Wir nehmen an, dass diese Reste stattdessen an der Pi-Bindung beteiligt sind. Um diese Hypothese zu testen, untersuchten wir die Auswirkungen der Alaninmutation dieser polaren Reste mithilfe von Pi-Transportassays (Abb. 6a). Die Rolle jedes Rests bei der Pi-Bindung wurde durch Transport-KM-Analyse bewertet (Tabelle 1). Die signifikantesten Veränderungen im KM wurden für Q281A und H256A gefunden, die im Vergleich zu WT eine sechs- bis siebenfache Reduzierung zeigten, was auf eine wichtige Rolle bei der Pi-Erkennung hinweist. Es ist zu beachten, dass diese Mutationen auch die Ca2+-Aufnahme stören12, was unserer Hypothese entspricht, dass die Bindungsstellen für Ca2+ und Pi proximal liegen.

a Pi-Transportkinetik-Assays, gemessen unter Verwendung von Inside-Out-Vesikeln: N69A, N99A, N252A, Q281A und H256A. Für Mutanten wurden unterschiedliche Konzentrationen (5x höher als WT) an Vesikeln verwendet, um nützliche Daten für die kinetische Analyse zu erhalten. Die Daten wurden mit (−) Kontrollvesikeln subtrahiert und dann mit GraphPad 9 in die Michalis-Menten-Kinetik eingepasst. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar (n = 3). b Übersicht über das YfkE-Modell entlang der Membranebene betrachtet; Die beiden Wiederholungen mit umgekehrter Topologie, die jeweils aus fünf Transmembranhelices bestehen, sind in Orange (TM1-TM5) und Marineblau (TM6-10) gefärbt. Eine Transmembranhelix (TM0) geht der N-terminalen Wiederholung voraus. Die Bindungsstellen für Ca2+ (magentafarbene Kugel) und Pi (gelbe und rote Kugeln) werden durch Reste in den sogenannten Alpha-Repeats, also TM2-TM3 und TM7-TM8, gebildet. c Nahaufnahme der hypothetischen Struktur der Bindungsstelle für Ca2+ und Pi in YfkE. Reste, die an der Ionenkoordination beteiligt sind, werden hervorgehoben. Das vorgeschlagene Interaktionsnetzwerk ist mit schwarzen Linien gekennzeichnet. d Wie c, mit überlagerten Belegungskarten, die aus dem in dieser Studie generierten Modellensemble berechnet wurden. Konkret zeigt die Abbildung eine Kontur der Belegungskarten bei einem 85-%-Wert für beide Proteinseitenketten (graues Netz), Ca2+ (grünes Netz) und Pi (rotes Netz). Das heißt, der Anteil der Struktur innerhalb der Konturen ist über 85 % des Ensembles ungefähr gleich, während der Anteil außerhalb variabel ist.

Nachdem wir festgestellt hatten, dass die bestehende, nach innen gerichtete Struktur von YfkE einen H+-gebundenen Zustand und keine Apo-Konformation darstellt, haben wir mit der Modellierung der Änderungen in dieser Struktur begonnen, die erklären könnten, wie Ca2+ und monoanionisches Pi nach H+ gleichzeitig erkannt und transportiert werden werden entladen. Zu diesem Zweck haben wir ein Verfahren verwendet, das der herkömmlichen Homologiemodellierung ähnelt und so angepasst ist, dass nur Lösungen berücksichtigt werden, die eine Reihe geometrischer Einschränkungen erfüllen, die die biochemischen und funktionellen Daten widerspiegeln, die wir für diesen Antiporter erhalten haben (weitere Einzelheiten finden Sie unter „Methoden“). Das Modell umfasst auch Informationen, die aus einer Untersuchung der Proteindatenbank stammen, insbesondere von einem Protein bekannter Struktur, das gleichzeitig auch Ca2+ und Pi erkennt, nämlich einer Ca2+-abhängigen Hydrolase namens PON116. Dieses Protein weist eine Donut-förmige Struktur mit einer zentralen Stelle auf, an der Ca2+ und Pi koordiniert sind, die der Bindungsstelle in YfkE und VCX1 auffallend ähnlich zu sein scheint (ergänzende Abbildung 8).

Um den Bereich der Seitenkettenkonfigurationen, die mit den oben aufgeführten Beschränkungen kompatibel sind, angemessen zu untersuchen, haben wir ein Ensemble von insgesamt 2000 Modellen erstellt. Anschließend analysierten wir dieses Konformationsensemble mithilfe eines Clustering-Algorithmus, der auf paarweiser Ähnlichkeit basiert (weitere Einzelheiten finden Sie unter „Methoden“). Das in Abb. 6b–d dargestellte Modell ist repräsentativ für den bevölkerungsreichsten Cluster, der etwa 52 % aller produzierten Modelle umfasst. Konstruktionsbedingt weist das Modell minimale Abweichungen in der Konformation des Rückgrats relativ zur experimentellen Struktur des H+-gebundenen Zustands auf. Dennoch scheint klar, dass eine Neuanordnung einer begrenzten Anzahl von Seitenketten ausreicht, um ein Modell zu erstellen, das nicht nur chemisch plausibel ist, sondern auch mit vorhandenen experimentellen Daten übereinstimmt. Insbesondere wird Ca2+ durch gleichzeitige zweizähnige Wechselwirkungen mit den Carboxylatgruppen von E72 und E255 sowie durch die Carbonyle von G68 und N69 koordiniert. Pi befindet sich in unmittelbarer Nähe und wird von mehreren Resten koordiniert, die als Wasserstoffdonoren fungieren, zusätzlich zu H256, das offenbar als Akzeptor fungiert. Obwohl dieses nach innen gerichtete Modell per Definition hypothetisch ist, gehen wir davon aus, dass es einen plausiblen strukturellen Kontext für unsere biochemischen und physiologischen Daten bietet und zeigt, dass die gleichzeitige Erkennung von Ca+ und Pi an einer gemeinsamen Stelle innerhalb von YfkE durchaus möglich ist.

Schwankungen der zytosolischen Ca2+-Konzentration sind eine universelle zelluläre Signalstrategie. Die Ca2+-vermittelte Signalübertragung hängt jedoch nicht nur von der Größe der Konzentrationsänderungen ab, sondern auch von der spezifischen Geschwindigkeit, Häufigkeit und den räumlich-zeitlichen Mustern dieser Änderungen. Die Erzeugung dieser komplexen Signale als Reaktion auf Reize erfordert die konzertierte Wirkung von Ca2+-Kanälen, Transportern und Pumpen auf der Plasmamembran und den Membranen intrazellulärer Organellen, um den Ca2+-Zustrom und -Ausfluss zu regulieren9,17. In einzelligen Organismen und höheren Pflanzen stellen CAX-Antiporter einen der Hauptmechanismen für die Aufrechterhaltung dieses komplexen Ca2+-Gleichgewichts dar3,18.

In dieser Studie enthüllen wir eine Art Regulierungsmechanismus von CAX. Wir fanden heraus, dass die H+/Ca2+-Austauschaktivität des bakteriellen CAX-Homologs YfkE in Gegenwart von Pi stark beschleunigt werden kann. Darüber hinaus deuten unsere Ergebnisse unter Verwendung sowohl von E. coli-Vesikeln (Abb. 2a) als auch rekonstituierter Proteolipsomen (Abb. 2d) stark darauf hin, dass YfkE Pi gemeinsam mit Ca2+ transportiert; Das heißt, Pi könnte als „Transportbegleiter“ angesehen werden, der den Ca2+-Ausfluss erleichtert. Basierend auf unseren Transporttests ist die Kopplung von Ca2+ und Pi hochspezifisch (ergänzende Abbildung 1), aber diese beiden Ionen weisen eine unterschiedliche Affinität auf, d. h. der scheinbare KM für Ca2+ beträgt 0,15 mM (Abb. 1b), während der für Pi beträgt 5 mM (Abb. 3c), was auch durch die ITC-Experimente (Abb. 2f) belegt wird. Diese Ungleichheit könnte auf ihre unterschiedlichen Konzentrationen in den Zellen zurückzuführen sein. Zytosolisches [Ca2+] wird unterhalb von μM streng kontrolliert9,19, wohingegen Pi sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Zellen mit 1–10 mM viel häufiger vorkommt20,21. Die Fülle an zytosolischem Pi sollte es YfkE ermöglichen, Ca2+ und Pi unter typischen physiologischen Bedingungen gemeinsam zu transportieren.

Pi ist nicht nur ein wichtiger Bestandteil im Zellstoffwechsel, sondern dient auch als Signalmolekül22. Zur Erleichterung der Phosphathomöostase stehen mehrere Pi-Transportsysteme zur Verfügung. In Bakterien und Hefen reagieren spezifische Pi-bindende Proteine ​​auf Veränderungen der Pi-Verfügbarkeit in der Umgebung an der Plasmamembran und leiten intrazelluläre Signale weiter, um die Expression von Genen, die an der Pi-Aufnahme beteiligt sind, hochzuregulieren23,24. Unser Befund, dass die Ca2+-Effluxaktivität von YfkE durch die Verfügbarkeit von zytosolischem Pi reguliert wird, lässt die Hypothese aufkommen, dass CAX-Proteine ​​an der Homöostase von Ca2+ und Pi, zwei essentiellen Ionen in den Zellen, beteiligt sind. Es wurde zuvor vermutet, dass YfkE an der Sporulation in Bacillus subtilis25 beteiligt ist. Interessanterweise wurde die Ca2+-Anreicherung als Calciumphosphatsalz in retrogressiven Bacillus-Sporen gefunden26. Es ist möglich, dass YfkE seine Ca/Pi-Kotransportaktivität nutzt, um diesen Prozess zu regulieren. Alle diese Hypothesen erfordern weitere Untersuchungen, es ist jedoch erwähnenswert, dass der Ca2+-Pi-Kotransport sowohl in Bakterien als auch in Pflanzen beschrieben wurde. Rosen et al. fanden heraus, dass der Ca2+-Ausfluss in E. coli durch zwei Transportsysteme vermittelt wird, eines Pi-unabhängig und eines Pi-abhängig27. Bei Arabidopsis führt eine Störung der vakuolären H+/Ca2+-Transporter CAX1 und CAX3 zu deutlichen Veränderungen im Pi-Gehalt28. Unsere biochemischen, biophysikalischen und rechnerischen Analysen zeigen, dass YfkE Ca2+ und Pi an einer gemeinsamen Stelle erkennt, durch direkte oder indirekte Wechselwirkungen mit Resten, die in vielen CAX-Proteinen konserviert sind, einschließlich E72, E255, N69, N99, Q252, Q281 und H256 ( Ergänzende Abbildung 7). Daher erscheint es plausibel, dass der von uns für YfkE beobachtete Co-Transportmechanismus ein gemeinsames Merkmal innerhalb der CAX-Familie sein könnte.

Während der Transportmechanismus von YfkE und anderen CAX-Proteinen durch das Alternating-Access-Modell wahrscheinlich genau beschrieben werden kann, sind für eine Bestätigung weitere Strukturinformationen erforderlich, die über die vorhandenen nach innen gerichteten Zustände hinausgehen. Unsere funktionellen und strukturellen Analysen offenbaren einen Regulationsmechanismus von YfkE, der durch die Verfügbarkeit von zytosolischem Pi aktiviert wird. In Abwesenheit oder geringer Häufigkeit von Pi funktioniert YfkE in einem H+/Ca2+-Austauschmodus mit geringem Efflux, der eine Ionenkonkurrenz um E72 und E255, die beiden Carboxylatreste an der zentralen Stelle, beinhaltet (Abb. 7a). Sowohl E72 als auch E255 sind funktionell unerlässlich. Wie bereits erwähnt, zeigen unsere Berechnungsergebnisse, dass YfkE das transportierte H+ bei E255 und E72 trägt (Tabelle 2). Unsere ITC-Experimente (Abb. 5c–e) legen nahe, dass die anfängliche Ca2+-Bindung an den nach innen gerichteten Zustand eine Verdrängung des an E255 gebundenen H+ erfordert, jedoch nicht unbedingt an E72 (Tabelle 2). Beide Protonen müssen jedoch freigesetzt werden, bevor der Transporter in den nach außen gerichteten Zustand zurückkehren kann. Es ist daher möglich, dass die vollständige Deprotonierung der zentralen Stelle nach der Bindung von Ca2+ an eine teilweise protonierte Form aus kinetischer Sicht ein limitierender Faktor ist.

Ein YfkE behält in Abwesenheit von Pi einen Low-Efflux-Transportmodus bei, bei dem der abwechselnde Zugang von H+/Ca2+ den Konformationsübergang zwischen dem nach innen gerichteten und dem nach außen gerichteten Zustand auslöst. b Das Vorhandensein (oder der Anstieg) von zytosolischem Pi fördert YfkE zu einem H+/Ca-Pi-Kotransportmodus mit hohem Fluss. In beiden Modi überträgt E72 H+ (grüne Kugel) auf E255, um Ca2+ (blaue Kugel) zu dissoziieren. Im Co-Transportmodus erleichtert Pi (rote Kugel), das zwischen E255 und H256 neben Ca2+ gebunden ist, den Transportumsatz.

Die Erhöhung des zytosolischen [Pi] schaltet den Transporter in einen Hochflussmodus, indem der Ca2+-Ausfluss an den Co-Transport von Pi gekoppelt wird, wobei beide Ionen nebeneinander an der zentralen Stelle im Pfad erkannt werden (Abb. 7b), wie unser Docking-Modell nahelegt und Mutationsstudien (Abb. 6). Der Mechanismus, durch den Pi den Ca2+-Ausfluss beschleunigt, bedarf weiterer Untersuchungen. Wenn zytosolisches Pi in ausreichender Menge vorhanden ist, könnte Pi die Thermodynamik der H+/Ca2+-Austauschreaktion verändern, die durch den nach außen gerichteten Transmembrangradienten von Pi zusätzlich zum nach innen gerichteten H+-Gradienten angeregt würde. Alternativ oder zusätzlich könnte die Pi-Bindung zusätzlich zu Ca2+ dazu beitragen, die vollständige Entladung von H+ aus dem Transporter zu beschleunigen und ihm so den Übergang zwischen nach innen und außen gerichteten Zuständen zu ermöglichen, während er an Ca2+ gebunden ist. Diese Hypothese wird durch die kinetischen Analysen gestützt, in denen die Kopplung von Pi zu einem starken Anstieg von Vmax des transportierten Ca2+ um das 8-fache führt, während die Bindungsaffinität des transportierten Ca2+ (KM) leicht verringert wird. Gebundenes Pi interagiert gemäß unserem hypothetischen Strukturmodell nicht direkt mit E72, befindet sich jedoch in der Nähe von E255 (Abb. 6c, d). Somit ist es möglich, dass die Freisetzung von H+ aus E72 über E255 erfolgt und dass monoanionisches Pi eine vorübergehende Protonierungsstelle zwischen E255 und H256 bedient, die dann das H+ in das Zytosol entladen würde. Pi würde daher den Transportumsatz beschleunigen, indem es die vollständige H+-Dissoziation aus dem nach innen gerichteten Zustand beschleunigt. Bemerkenswert ist, dass der Vmax des Pi-Transports seinen Höhepunkt bei pH 7,5 erreicht, was sehr nahe am pKa (7,2) des Gleichgewichts zwischen monoanionischen H2PO41−- und dianionischen HPO42−-Spezies liegt (Abb. 3g). Interessanterweise wurde auch ein Pi-vermittelter H+-Transfermechanismus (zwischen zwei Carboxylatresten) für einen H+/Phosphat-Transporter vorgeschlagen29. Es ist daher denkbar, dass diese Art von H+-Hopping-Mechanismen bei Pi-gekoppelten Transportern üblich ist. Trotz der Verfügbarkeit mehrerer Strukturen von CAX11,12,13 war die Stöchiometrie von H+ vs. Ca2+ schwer zu bestimmen, da ihre Bestimmung technisch weiterhin anspruchsvoll ist. In dieser Studie haben wir herausgefunden, dass die Transportaktivität eines CAX-Homologs durch die Anwesenheit von Pi reguliert wird, das selbst eine protonierbare Spezies ist. Daher ist eine sorgfältige Charakterisierung der H+-Kopplung in jedem Transportmodus erforderlich, um das Zusammenspiel zwischen Pi, Ca2+ und H+ in diesem Austauschmechanismus zu analysieren.

YfkE gehört zur CaCA-Superfamilie, die bisher mehr als 200 Mitglieder in allen Lebensbereichen umfasst18. Alle CaCA-Homologen weisen die beiden als α-Repeats bekannten Sequenzmotive (TM2-3 und TM7-8) mit den beiden Carboxylatresten auf, die für die H+/Na+/Ca2+-Koordination verwendet werden (z. B. E72 und E255 in YfkE). Diese Motive sind jedoch nicht streng konserviert, und Sequenzvariationen darin scheinen die Substratselektivität verschiedener Transporter zu modulieren und letztendlich zu bestimmen, ob das Kopplungsion im Austauschzyklus H+ oder Na+11,12,13,30 ist (ergänzende Abbildung 9). . In YfkE ermöglicht die Protonierung von E72 und E255 im nach außen gerichteten Zustand dem Transporter, die nach innen gerichtete Konformation zu erreichen, die dann zytosolisches Ca2+ (und Pi) laden kann. E54 und E213, die beiden entsprechenden Carboxylatreste im Na+/Ca2+-Austauscher NCX_Mj, können ebenfalls H+ im nach außen gerichteten Zustand binden, der Transporter wird dann jedoch gehemmt31,32, da er nicht auf den nach innen gerichteten Zustand zugreifen kann33, im Einklang mit Tatsache, dass NCX_Mj kein H+ transportiert 30,33. Im Gegensatz dazu erleichtert die Na+-Bindung diesen Konformationsübergang, sodass NCX_Mj den nach innen gerichteten Na+-Gradienten nutzen kann. Die Entsprechung zwischen Transport- und Bindungsspezifikationen ist daher nicht trivial und erfordert die Abbildung der Energetik des gesamten Wechselzugriffszyklus. Darüber hinaus führen Sequenzvariationen auch zu komplexeren Ionenabhängigkeiten. Beispielsweise katalysiert NCKX in Gehirnzellen den gemeinsamen Transport von K+ und Ca2+ im Austausch gegen Na+. Diese K+-Abhängigkeit wurde einem einzelnen Aspartatrest innerhalb der zweiten α-Wiederholungen zugeschrieben34. In Mitochondrien kann der Na+/Ca2+-Austauscher NCLX auch Li+ im Austausch von Ca2+ transportieren, und dieser Transportmodus ist von einer einzelnen Aminosäuresubstitution in der zweiten Wiederholung abhängig35. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass H256, das bei vielen CAX-Proteinen (und auch in der zweiten Wiederholung) konserviert ist, aber in Na+/Ca2+-Austauschern durch Leucin/Threonin ersetzt wird (ergänzende Abbildung 9), der essentielle Rest ist, der den Ca2+-Pi-Kotransport ermöglicht YfkE. Dieses Histidin ist in einigen prokaryotischen CAXs nicht vorhanden, z. B. befindet sich in ChaA, einem CAX-Homolog aus E. coli, ein Glycinrest an der entsprechenden Position (ergänzende Abbildung 9). ChaA unterscheidet sich jedoch von YfkE dadurch, dass es den H+-gekoppelten K+- oder Na+-Ausfluss vermittelt36,37. Daher scheint es plausibel, dass Ca2+/Pi-Kotransportaktivität in anderen CAX-Homologen vorhanden sein könnte. Auf jeden Fall liefern unsere Ergebnisse zusätzliche Beweise dafür, dass CaCA-Proteine ​​ihre Substratselektivität durch Feinabstimmung der für die Ca2+-Erkennung verwendeten α-Repeat-Motive verändern, was zu unterschiedlichen Energie- oder Regulierungsmechanismen in verschiedenen Zelltypen führt.

Inside-Out-Vesikel (ISOs) wurden durch ein Niederdruck-Homogenisierungsverfahren hergestellt. Kurz gesagt, E. coli BL21(DE3)-Zellen, die einen pET28a-YfkE-Vektor beherbergen, wurden in Luria-Brühe-Medium bei 37 °C bis zu einem A600 von 0,4 gezüchtet. Mutationen wurden mithilfe eines standardmäßigen ortsspezifischen Mutageneseansatzes erzeugt und durch Sequenzierung bestätigt. Die Proteinexpression wurde durch Zugabe von 0,2 mM Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) für 2 Stunden bei 25 °C induziert. Die Zellen wurden mit Puffer gewaschen, der 10 mM Tris-HCl, pH 7,3, 140 mM KCl, 0,5 mM DTT und 250 mM Saccharose enthielt. Der Zellaufbruch wurde durch einen einzigen Durchgang durch einen C3-Homogenisator (Avestin) bei niedrigem Druck (4000 psi) durchgeführt. Nach der Entfernung von Zelltrümmern durch Zentrifugation wurden die Überstände mit einem Ti45-Rotor 1 Stunde lang bei 40.000 U/min zentrifugiert, um Membranvesikel zu pelletieren. Vesikel wurden im gleichen Puffer homogenisiert und dann vor der Verwendung schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren.

Sowohl die Ca2+- als auch die Pi-Transportaktivitäten von YfkE wurden mithilfe von Inside-Out-Vesikeln gemessen. Kurz gesagt, Membranvesikel wurden in einem Puffer (pH 8,0) verdünnt, der die gleichen Komponenten enthielt. Vor den Tests wurde ein H+-Gradient nach außen durch Zugabe von 5 mM NADH zu den Vesikeln für 10 Minuten hergestellt. Obwohl es möglich ist, dass in unseren Proben eine kleine Anzahl von Vesikeln mit der rechten Seite nach außen vorhanden ist, kann die Elektronentransportkette in diesen Vesikeln nicht mit Energie versorgt werden, da NADH membranundurchlässig ist. Daher wird nur die Aktivität der Inside-Out-Vesikel gemessen. Zur Messung der Ca2+-Transportaktivität wurden den Vesikeln außerdem 5 mM kaltes Kaliumphosphat zugesetzt. Um die Phosphattransportaktivität zu messen, wurde stattdessen 0,5 mM kaltes CaCl2 zugegeben. Transporttests wurden durch Zugabe von 45Ca2+ oder 32P-Pi (Perkin Elmer), wie in den Reaktionen angegeben, bei Raumtemperatur ausgelöst. Die Reaktionen wurden durch Filtration durch eine Nitrozellulosemembran (0,22 µm) auf einem Millipore-Filtrationsverteiler beendet und dann sofort mit Puffer gewaschen. Die Filter wurden luftgetrocknet und in einem Flüssigkeitsszintillationszähler gezählt, um die Transportaktivität zu bestimmen. Die kinetische Analyse wurde durch Datenanpassung in das Michaelis-Menten-Einzelexponentialmodell unter Verwendung der Software Graphpad Prism 9 durchgeführt. Für Vesikeltests wurden Membranvesikel, die mit BL21(DE3)-Zellen hergestellt wurden, die einen leeren Vektor enthielten, als Kontrolle verwendet. Für kinetische Tests von Mutanten wurde die Konzentration der Vesikel individuell angepasst, um nützliche Daten für die Modellanpassung zu erhalten.

Die Proteine ​​von YfkE WT und Varianten wurden mit dem gleichen Ansatz exprimiert und gereinigt. Kurz gesagt, die Proteinexpression wurde im Stamm E. coli C41(DE3) in Autoinduktionsmedium38 bei 25 °C über Nacht durchgeführt. Die Zellen wurden in einem Puffer suspendiert, der 20 mM Na-Phosphat, pH 7,4, 500 mM NaCl und 20 mM Imidazol enthielt, und dann durch drei Passagen durch einen C3-Homogenisator (Avestin) bei 15.000 psi aufgebrochen. Membranfraktionen wurden wie oben beschrieben gesammelt und in der Lyse suspendiert Puffer. Membranfraktionen wurden durch Zugabe von 1 % (Gew./Vol.) n-Dodecyl-β-maltosid (DDM) bei 4 °C für 1 Stunde solubilisiert und mit Ni-NTA-Harz (GE Healthcare) inkubiert. Die Harze wurden mit Puffer, ergänzt mit 60 mM Imidazol und 0,05 % DDM, gewaschen und dann mit Puffer, ergänzt mit 400 mM Imidazol und 0,05 % DDM, eluiert. Das eluierte Protein wurde unter Verwendung einer Superdex-200 10/300 GL-Säule (GE Healthcare) weiter gereinigt, die in einem Puffer mit 20 mM HEPES (pH 7,4), 500 mM NaCl und 0,05 % DDM äquilibriert war.

Proteoliposomen wurden unter Verwendung von E. coli-Gesamtlipid (Avanti polar lipids Inc.) wie folgt hergestellt: In Chloroform gelöste Lipide wurden zunächst unter Inertgas getrocknet, um einen dünnen Lipidfilm in einem Glasröhrchen zu bilden, und dann über Nacht unter Vakuum gehalten, um restliches Chloroform zu entfernen. Der Lipidfilm wurde dann in 20 mM HEPES (pH 7,4), 100 mM NaCl resuspendiert und dann auf Eis beschallt, bis die Suspension klar wurde. Nach zwei Einfrier-Auftau-Zyklen wurden die erzeugten großen multilamellaren Vesikel 11 Mal durch einen 400-nm-Polycarbonatfilter geleitet, um unter Verwendung eines Miniextruders (Avanti Polar Lipids Inc.) unilamellare Liposomen zu bilden. Vor der Rekonstitution wurden die Liposome zunächst durch Zugabe von 5 µl 10 % Triton X-100 (Gew./Vol.) pro 1 mg Lipide bei Raumtemperatur für 30 Minuten destabilisiert. Das YfkE-Protein wurde 20 Minuten lang mit durch Detergens destabilisierten Liposomen im Verhältnis 1:10 (w:w) auf Eis gemischt. Das Reinigungsmittel wurde durch Zugabe von Biokügelchen zu der Mischung (80 mg Kügelchen für 1 ml Probe) entfernt, um über Nacht bei 4 °C und leichtem Rühren Proteoliposomen zu bilden. Am nächsten Tag wurden für weitere 3 Stunden frische Biokügelchen hinzugefügt, um die Rekonstitution abzuschließen.

Um die Pi-Transportaktivität zu messen, wurden 200 µl 4 mg/ml YfkE-rekonstituierte Proteoliposomen (pH = 7,4) in 400 µl Puffer verdünnt, der 20 mM HEPES (pH = 8,0), 100 mM NaCl, 5 mM 32P-Phosphat (Perkin Elmer) enthielt. und 0,5 mM CaCl2 (oder 2 mM EDTA als Kontrolle) bei Raumtemperatur. Zu den angegebenen Zeiten wurde die Reaktion durch Filtration durch eine Nitrozellulosemembran (0,22 µm) auf einem Millipore-Filtrationsverteiler beendet und dann sofort mit Puffer gewaschen. Anschließend wurden die Filter an der Luft getrocknet und in einem Flüssigkeitsszintillationszähler gezählt, um die Transportaktivität zu bestimmen.

Vor den Tests wurden 10 µg gereinigte His-Tag-YfkE-Proteine ​​mit 100 µl Ni-NTA-Perlen gemischt. 40 mM 32Pi wurden 10 Minuten lang in Gegenwart von 0,5 mM Ca2+ zu den Perlen gegeben. Anschließend wurden die Perlen ausgiebig mit einem Proteinpuffer ohne Pi gewaschen. Die Proteine ​​wurden mit 250 mM Imidazol eluiert und die Radioaktivität mit einem Szintillationszähler gemessen.

Proteinkonformationsänderungen in der nativen Membranumgebung wurden mithilfe von LRET in ISOs erfasst. Um eine spezifische Markierung sicherzustellen, wurden zwei endogene Cysteinreste (C34 und C293) mithilfe ortsgerichteter Mutagenese durch Valin ersetzt, um ein Cystein-freies YfkE-Konstrukt zu erzeugen. Anschließend wurde ein Paar Cysteinreste zur Fluorophormarkierung eingeführt: Ein Cysteinrest C3 wurde am N-Terminus eingefügt und ein weiterer Cysteinrest wurde basierend auf der YfkE-Struktur an der Position 56 oder 202 platziert. Eine Amino-terminale flankierende Sequenz unmittelbar nach C3 enthält einen His6-Tag, um den Abstand zwischen Donor und Rezeptor für optimale LRET-Signale zu vergrößern, und eine Thrombin-Spaltungsstelle zur Hintergrundnormalisierung.

ISO wurde mit dem oben beschriebenen Ansatz erstellt. Die Vesikelmarkierung erfolgte mittels Thiol-reaktiver Chemie 1 Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln unter Verwendung von 200 nM Maleimidderivaten von Donor- und Akzeptor-Fluorophoren. Die verwendeten Fluorophore sind Terbiumchelat (Invitrogen) und Atto-465 (Sigma). Nach der Markierung wurden die Vesikel zweimal gegen einen Puffer mit 10 mM HEPES pH 7,3, 140 mM KCl und 250 mM Saccharose 2 Stunden lang bei 4 °C dialysiert, um überschüssige Sonden zu entfernen. Vor dem Fluoreszenzscannen wurden 0,5 mM CaCl2 und/oder 5 mM Kaliumphosphat (pH 7,3) mit Vesikeln vermischt.

Fluoreszenzmessungen wurden mit einem küvettenbasierten Fluoreszenzlebensdauerspektrometer QuantaMaster Modell QM3-SS (Photon Technology International) durchgeführt. Für jedes Experiment wird ein Durchschnitt von drei Messungen für einen bestimmten Zustand angegeben, wobei jede Messung einen Durchschnitt von 99 Impulsen von der Blitzlampe aufweist. Die Daten wurden mit der Fluorescan-Software (Photon Technology International) gesammelt und mit der Origin-Software (OriginLab Corp) analysiert. Die sensibilisierte Emission des Akzeptors wurde vor und nach der Thrombinspaltung nachgewiesen, einer bewährten Technik zur Subtraktion der Hintergrundfluoreszenz39,40,41. Insbesondere wurden nach der Messung der Akzeptorlebensdauer fünf Einheiten Rinderthrombin (Calbiochem) in die Küvette gegeben und man ließ das N-terminal markierte Fluorophor abspalten. Die Spaltung war 1–3 Stunden nach der Zugabe von Thrombin abgeschlossen. Die Donor-Akzeptor-markierte Probe wurde bei 337 nm angeregt und die Emission wurde bei 508 nm nachgewiesen. Die Entfernungen wurden mithilfe der Förster-Gleichung (Gl. (1)) berechnet:

Die Ca2+- und Pi-Bindungsaffinität wurde mittels isothermer Titrationskalorimetrie (ITC) bestimmt. Die Proteine ​​wurden durch Zugabe von 10 mM EGTA entkalkt und dann mittels Größenausschlusschromatographie getrennt. Die Ca2+- oder Pi-Lösung wurde im gleichen Puffer hergestellt. ITC-Assays wurden durch Titrieren von Ca2+ in eine Lösung von 5 oder 10 μM YfkE-Protein auf einem VP-ITC-Gerät (Microcal LLC) durchgeführt. Alle Tests verwendeten das gleiche ITC-Programm: Das System wurde thermisch bei 25 °C äquilibriert; Nach einer anfänglichen Verzögerung von 120 s wurden serielle Injektionen (jeweils 10 μl) mit einer Abstandszeit von 240 s und einer Rührgeschwindigkeit von 307 U/min durchgeführt. Jede Messung wurde mit einer Hintergrundtitration korrigiert, bei der der Ligand in eine Pufferlösung titriert wurde. Die Datenanpassung wurde mit der Origin-Software (Microcal LLC) durchgeführt.

Die Simulationen basierten auf der Kristallstruktur von nach innen gerichtetem YfkE (PDB 4KJR)12. Alle Simulationen wurden mit NAMD 2.942 unter Verwendung des CHARMM36-Kraftfelds für Proteine ​​und Lipide43,44 durchgeführt. Alle Simulationen wurden bei konstanter Temperatur (298 K) und semiisotropem Druck (1 atm) unter Verwendung periodischer Randbedingungen und einem Integrationszeitschritt von 2 fs durchgeführt. Elektrostatische Wechselwirkungen über große Entfernungen wurden mithilfe von PME mit einem Realraum-Grenzwert von 12 Å berechnet. Van-der-Waals-Wechselwirkungen wurden mit einem Lennard-Jones-Potential berechnet, das bei 12 Å abschneidet und bei 10 Å eine glatte Schaltfunktion in Kraft tritt. Das untersuchte spezifische Proteinkonstrukt ist ein einzelnes Protomer, das die Reste 1–177 (TM-TM5) und die Reste 200–351 (TM6-TM10) umfasst; Die scheinbar unstrukturierte zytoplasmatische Schleife, die TM5 und TM6 verbindet, wurde abgeschnitten. Das Proteinkonstrukt wurde mit GRIFFIN45 in eine voräquilibrierte hydratisierte Palmitoyl-Oleoyl-Phosphatidyl-Cholin (POPC)-Lipiddoppelschicht eingebettet und in einer orthorhombischen Box mit einer Größe von ~88 × 88 × 95 Å eingeschlossen. Das resultierende Simulationssystem enthält ungefähr 76.700 Atome, darunter 207 Lipidmoleküle und einen 100 mM KCl-Puffer (ergänzende Abbildung 6). Das Simulationssystem wurde nach einem abgestuften Protokoll äquilibriert, das eine Reihe von MD-Trajektorien umfasste, bei denen Positions- und Konformationsbeschränkungen, die auf die Proteinstruktur einwirken, über 100 ns allmählich abgeschwächt werden. Um den Protonierungszustand einer bestimmten Seitenkette im Protein anhand einer Referenz mit bekanntem pKa zu bewerten, wurde eine Aminosäure des gleichen Typs frei in Lösung in das Simulationssystem einbezogen. Diese Aminosäure wurde am N-Terminus mit einer Acetylmodifikation und am C-Terminus mit einem sekundären Amid neutralisiert, um die Protonierungsenergetik der Seitenkette zu isolieren. Während der Simulationen wurde die freie Aminosäure in Lösung gehalten und durch eine Reihe abstoßender Potentiale, die in einem bestimmten Schwellenabstand wirkten, von allen anderen gelösten Stoffen (Protein, Membran, Ionen) ferngehalten. Duale Topologien (protoniert und deprotoniert) wurden sowohl für die Proteinseitenkette als auch für ihr Äquivalent in Lösung eingeführt. Anschließend wurde der Free-Energy Perturbation (FEP)-Algorithmus verwendet, um die Protonierungszustände beider Seitenketten gleichzeitig, aber in entgegengesetzte Richtungen zu ändern; Somit spiegelt der resultierende Wert der freien Energie die Zunahme oder Abnahme der Protonierungsneigung der Proteinseitenkette in Bezug auf das wider, was für diesen Seitenkettentyp in Lösung intrinsisch ist (ergänzende Abbildung 6). Diese Transformation wurde in beide Richtungen durchgeführt, d. h. Protonierung der Proteinseitenkette und Deprotonierung der freien Aminosäure und umgekehrt. Die in Tabelle 2 dargestellten ΔΔG-Werte spiegeln den Mittelwert dieser beiden Berechnungen wider; die halbe Differenz wird als Fehlerbalken angegeben. Jede Berechnung bestand aus einer Reihe aufeinanderfolgender MD-Simulationen, bei denen sich ein Parameter l von 0 auf 1 (oder umgekehrt) ändert, wenn eine Topologie schrittweise durch die andere ersetzt wird, während die entsprechenden Änderungen der potenziellen Energie für jeden Simulationsschnappschuss mit Anmerkungen versehen werden. Jede l-Transformation wurde in 40 Schritte diskretisiert, von denen jeder aus einer Simulation von 1 ns für Seitenketten im Proteininneren oder 240 ps für die beweglicheren Oberflächenseitenketten bestand. Diese 40 Simulationen wurden nacheinander durchgeführt; Nach jeder inkrementellen Änderung von l wurde ein Trajektorienfragment (200 bzw. 40 ps) als Gleichgewichtszeit berücksichtigt und bei der Berechnung der freien Energie weggelassen.

Wir haben Protein-Röntgenstrukturen analysiert, die die folgenden Kriterien erfüllen: (i) die Auflösung beträgt 3,0 Å oder besser; (ii) die Sequenzidentität mit einer zuvor ausgewählten Struktur beträgt weniger als 70 %; (iii) die Strukturen weisen ein Calcium- und ein Phosphation auf, die an einer gemeinsamen Bindungsstelle gebunden sind (dh der Mindestabstand zwischen den beiden Ionen beträgt 3,2 Å oder weniger); und (iv) die Bindungsstelle wird wie bei YfkE von zwei sauren und einer Histidin-Seitenkette flankiert. Diese Untersuchung ergab eine Struktur, nämlich die der Säugetierserumparaoxonase 1 (PON1), einer kalziumabhängigen Hydrolase (PDB-Eintrag 3SRE)46.

Das molekulare Modell von YfkE gebunden an Ca2+ und Phosphat wurde mit MODELLER v9.1347 erstellt. Das angewandte Verfahren ähnelte dem bei der Homologiemodellierung, mit der Ausnahme, dass hier das Ziel die unbekannte Struktur des Ca2+/Phosphat-gebundenen Zustands und die Vorlage die bekannte Struktur (PDB 4KJR)12 war. Lediglich die Struktur der vier TM-Helices, die die Bindungsstelle flankieren (die sogenannten α-Repeats, also die Reste 59–110 und 239–296), wurde umgestaltet. Um die Geometrie der Bindungsstelle mit gebundenem Ca2+ und Phosphat spezifisch zu modellieren, haben wir eine Reihe geometrischer Einschränkungen hinzugefügt, die aus den oben genannten Strukturen von PON1 und NCX_Mj16,30 sowie Ca2+/Phosphat-Transportstudien von Wildtyp- und mutierten Formen von YfkE abgeleitet wurden . Letztere haben insbesondere gezeigt, dass die folgenden Mutationen signifikante Veränderungen der gemessenen KM- und/oder Vmax-Werte verursachen, ohne den Transport aufzuheben: G68A, N69A, N99A, N252A, H256A und Q281A. Daher wurden Beschränkungen auf die folgenden Abstände zwischen Ca2+ und dem Protein angewendet, wobei ein harmonisches Potential verwendet wurde, das bei Abständen gleich oder größer als 2,6 Å (und einer „Abweichung“ von 0,1 Å) wirkt: (1) auf jedes der vier Sauerstoffatome aus den Carboxylatgruppen von E72 und E255; (2) zum nächstgelegenen Sauerstoffatom von Phosphat (modelliert als H2PO4−); (3) zum Carbonyl von G68; und (4) an den Carbonylsauerstoff der N69-Seitenkette. Zusammengenommen implizieren diese vier Einschränkungen eine Ca2+-Koordinationszahl von 7. Analoge Einschränkungen wurden auf die Abstände zwischen dem Phosphoratom und (5) Nδ von H256 bei 3,9 Å, (6) Cγ von N252 (4,5 Å) und (7) angewendet ) Cγ von S278 (4,5 Å); und zum Abstand zwischen (8) Oε von Q281 und Nδ von N69 (3,2 Å).; und (9) das zwischen Cγ von N252 und Cγ von N99 (4,2 Å). Um schließlich doppelt-zweizähnige Wechselwirkungen zwischen Ca2+ und E72 und E255 zu erzwingen, wurde auch eine Einschränkung auf (10) die Diederwinkel angewendet, die von Ca2+ und den Atomen Cδ, Oε1 und Oε2 von E72 und E255 gebildet werden (0°, mit ~ 20° Abweichung). Wir haben ein Ensemble von insgesamt 2000 Modellen generiert und dieses Ensemble durch Clustering basierend auf paarweisem RMSD analysiert; Diese RMSD-Berechnung umfasste alle Nichtwasserstoffatome der Reste N69, E72, N99, N252, E255, H256, S278 und Q281 sowie die Ca2+- und Phosphationen, und Cluster wurden durch einen RMSD-Schwellenwert von 0,6 Å definiert. Aus dieser Analyse resultierten 15 Cluster mit mehr als 10 Modellen, die zusammen 92 % der Modelle ausmachen.

Alle Experimente wurden mindestens dreimal durchgeführt (n = 3), um die Reproduzierbarkeit der Daten sicherzustellen. Alle Datenpunkte und Fehlerbalken (Standardabweichungen) sind in jeder Abbildung und gegebenenfalls in den Zusatzdaten angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Informationsdateien) enthalten. Quelldaten für die Abbildungen finden Sie in den Zusatzdaten 1.

Dateien für die MD-Simulation sind unter https://github.com/Faraldo-Gomez-Lab-at-NIH/Download verfügbar.

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Wir danken Mousheng Wu für die Anfangsphase dieser Studie. Diese Studie wurde durch den National Institutes of Health (NIH) Grant R01GM143418 und den American Heart Association Grant 18TPA34230046 an LZJDF-G unterstützt. wird von der Abteilung für intramurale Forschung des National Heart, Lung and Blood Institute, NIH, finanziert. Die Rechenressourcen wurden teilweise von der wissenschaftlichen Recheneinrichtung des NIH, Biowulf, bereitgestellt.

Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, Zentrum für Membranbiologie, Health Science Center der University of Texas an der Houston McGovern Medical School, Houston, TX, USA

Wei Niu, Shuo Lu, Trung Vu, Vasanthi Jayaraman und Lei Zheng

Theoretisches Labor für molekulare Biophysik, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA

Wenchang Zhou & José D. Faraldo-Gómez

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Konzeptualisierung: JDF-G. und LZ; Analyse: WN, WZ, SL, TV, VJ, JDF-G. und LZ; Untersuchung: WN, SL, WZ, TV und VJ; Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung: JDF-G. und LZ; Schreiben – Rezension und Bearbeitung: alle Autoren; Betreuung: JDF-G. und LZ; Projektverwaltung: JDF-G. und LZ; Fördermitteleinwerbung: JDF-G. und LZ alle Autoren haben das Manuskript gelesen und sind damit einverstanden.

Korrespondenz mit José D. Faraldo-Gómez oder Lei Zheng.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Janesh Kumar und Gene Chong.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Niu, W., Zhou, W., Lu, S. et al. Ca2+-Ausfluss erleichtert durch Co-Transport anorganischer Phosphatanionen im H+/Ca2+-Antiporter YfkE. Commun Biol 6, 573 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04944-6

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Eingegangen: 19. Mai 2022

Angenommen: 15. Mai 2023

Veröffentlicht: 29. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04944-6

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