Nachricht

Dec 05, 2023

Streichung des Autismus

Band Kommunikationsbiologie

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 593 (2023) Diesen Artikel zitieren

324 Zugriffe

7 Altmetrisch

Details zu den Metriken

CHD8 kodiert für das DNA-bindende Protein 8 der Chromodomäne Helikase und seine Mutation ist ein hochgradig durchdringender Risikofaktor für die Autismus-Spektrum-Störung (ASD). CHD8 fungiert aufgrund seiner Chromatin-Remodelling-Aktivität als wichtiger Transkriptionsregulator und steuert dadurch die Proliferation und Differenzierung neuronaler Vorläuferzellen. Die Funktion von CHD8 in postmitotischen Neuronen und im erwachsenen Gehirn ist jedoch weiterhin unklar. Hier zeigen wir, dass die homozygote Chd8-Deletion in postmitotischen Mausneuronen zu einer Herunterregulierung der Expression neuronaler Gene führt und die Expression aktivitätsabhängiger Gene verändert, die durch KCl-vermittelte neuronale Depolarisation induziert werden. Darüber hinaus war die homozygote Ablation von CHD8 bei erwachsenen Mäusen mit einer Abschwächung aktivitätsabhängiger Transkriptionsreaktionen im Hippocampus auf durch Kainsäure verursachte Anfälle verbunden. Unsere Ergebnisse lassen darauf schließen, dass CHD8 an der Transkriptionsregulation in postmitotischen Neuronen und im erwachsenen Gehirn beteiligt ist, und sie legen nahe, dass eine Störung dieser Funktion zur ASD-Pathogenese im Zusammenhang mit einer CHD8-Haploinsuffizienz beitragen könnte.

Die Autismus-Spektrum-Störung (ASD) ist eine heterogene Erkrankung, die durch Defizite in der sozialen Interaktion und Kommunikation sowie durch eingeschränkte und sich wiederholende Verhaltensweisen gekennzeichnet ist. Menschen mit Autismus-Spektrum-Störung zeigen oft zusätzliche Symptome wie Krampfanfälle, Angstzustände und geistige Behinderung1. Synaptische Dysfunktion ist ein Schlüsselmerkmal der ASD-Pathologie und tritt auch im Gehirn verschiedener Mausmodelle der Krankheit auf2,3,4. Durch Erfahrungen ausgelöste neuronale Aktivität trägt zur Regulierung der synaptischen Entwicklung und Funktion in neuronalen Schaltkreisen bei, indem sie die Transkription mehrerer Gene induziert5,6, was darauf hindeutet, dass eine Fehlfunktion einer solchen aktivitätsabhängigen Transkriptionsregulation zur Entwicklung von ASD beitragen kann.

Mutationen im Gen, das für das Chromodomänen-Helikase-DNA-bindende Protein 8 (CHD8) kodiert, stellen einen hochgradig durchdringenden Risikofaktor für ASD7,8 dar. CHD8 ist ein ATP-abhängiger Chromatin-Remodelling-Faktor, der auf die Promotorregionen vieler Gene, einschließlich der anderer mit ASD assoziierter Gene, abzielt und dadurch deren Transkription reguliert9,10,11. Es wurde festgestellt, dass heterozygote Chd8-Mausmutanten Makrozephalie, erhöhtes angstähnliches Verhalten, verändertes Sozialverhalten und kognitive Defizite zeigen, aber die Verhaltensphänotypen verschiedener Chd8-Mutantenmäuselinien, die von verschiedenen Gruppen erzeugt wurden, überschneiden sich nur teilweise12,13,14,15,16 ,17. Der Verlust von CHD8 führt auch zu einer beeinträchtigten Proliferation und Differenzierung von Vorläuferzellen für erregende Neuronen des Vorderhirns und für Kleinhirn-Körnerzellen während der kortikalen und Kleinhirnentwicklung18,19. Darüber hinaus spielt CHD8 eine Schlüsselrolle bei der Differenzierung und Myelinisierung von Oligodendrozyten, und seine Ablation in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen von Mäusen führt zur Entwicklung einiger Verhaltensphänotypen, die für heterozygote Chd8-mutierte Mäuse charakteristisch sind20,21,22. Obwohl diese verschiedenen Beobachtungen darauf schließen lassen, dass CHD8 ein zentraler Regulator der Proliferation und Differenzierung von Vorläuferzellen im Gehirn ist, ist unbekannt, ob CHD8 auch in postmitotischen Neuronen und im erwachsenen Gehirn eine wichtige Rolle spielt.

Wir haben nun die Folgen der Chd8-Deletion in postmitotischen Neuronen von Mäusen sowohl in vitro als auch im erwachsenen Gehirn in vivo mithilfe eines durch Tamoxifen induzierbaren Cre-Rekombinationssystems untersucht. Wir fanden heraus, dass CHD8 die Expression neuronaler Gene und aktivitätsabhängiger Gene in kultivierten Neuronen reguliert. Wir fanden auch heraus, dass die Deletion von Chd8 im erwachsenen Gehirn zu einer Herunterregulierung der aktivitätsabhängigen Genexpression führt, die mit durch Kainsäure (KA) verursachten Anfällen verbunden ist. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass CHD8 nicht nur in neuralen Vorläuferzellen, sondern auch in postmitotischen Neuronen als Transkriptionsregulator fungiert.

Um die Rolle von CHD8 in postmitotischen Neuronen zu untersuchen, kultivierten wir primäre Hippocampus-Neuronen, die aus Cre-Rekombinase-vermittelten Chd8-Knockout-Mäusen (CAG-CreER/Chd8F/F) und Kontrollmäusen (Chd8F/F) am Embryonaltag (E) 18,5 stammten (Abb. 1a). Die Kulturen wurden mit Cytosin β-D-Arabinofuranosid (Ara-C) behandelt, um sich teilende Zellen zu eliminieren, und dann 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) ausgesetzt, um Chd8-bedingte Knockout-Neuronen (Chd8 CKO) zu erzeugen. Die Häufigkeit von Chd8-mRNA in Chd8-CKO-Kulturen war im Vergleich zu Kontrollkulturen stark verringert (Abb. 1b). Die kultivierten Zellen umfassten zusätzlich zu Neuronen ~ 17 % Astrozyten und ~ 1 % Oligodendrozyten, aber der Anteil jedes Zelltyps und die Lebensfähigkeit der Zellen waren für Chd8-CKO- und Kontrollkulturen ähnlich (Abb. 1c, ergänzende Abb. 1). Wir führten eine RNA-Sequenzierungsanalyse (RNA-seq) mit diesen Chd8-CKO- und Kontrollneuronen durch (Ergänzungstabelle 1). Die Expression von 509 Genen war herunterreguliert und die von 360 Genen war in Chd8-CKO-Neuronen im Vergleich zu Kontrollneuronen hochreguliert (durch die Falscherkennungsrate (FDR) angepasster P-Wert von <0, 05) (Abb. 1d). Die Analyse der Genontologie (GO) ergab, dass die 509 herunterregulierten Gene in Chd8-CKO-Neuronen mit Genen angereichert waren, die mit „Translation“, „Transkription, DNA-gestützter Entwicklung“, „Entwicklung des Nervensystems“ und „positiver Regulierung des Synapsenaufbaus“ zusammenhängen Die 360 ​​hochregulierten Gene zeigten eine signifikante Anreicherung von Genen, die mit dem „zellulären Aminosäurestoffwechselprozess“ und dem „Transport“ zusammenhängen (Abb. 1e). Die SynGO-Analyse ergab, dass die herunterregulierten Gene in Chd8-CKO-Neuronen mit Genen angereichert waren, die mit der prä- und postsynaptischen Funktion zusammenhängen, wohingegen die hochregulierten Gene keine signifikante Anreicherung zeigten (Abb. 1f, ergänzende Abb. 2). Darüber hinaus zeigte die Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA) für die Pfade der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), dass ribosomale Gene in Chd8-CKO-Neuronen signifikant herunterreguliert waren (Abb. 1g).

a Schematische Darstellung des experimentellen Verfahrens zur Kultur primärer Neuronen, Deletion von Chd8 durch Cre-vermittelte Rekombination und KCl-induzierte neuronale Depolarisation (Einzelheiten siehe Methoden). Der Na+-Kanalblocker Tetrodotoxin (TTX) und der N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptorantagonist D-AP5 wurden Neuronen zugesetzt, um die neuronale Aktivität vor der KCl-induzierten Depolarisation zu reduzieren. b Analyse der reversen Transkription (RT) und Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (PCR) von Chd8-mRNA in Kontroll- und Chd8-CKO-Neuronen, behandelt mit 5 oder 55 mM KCl. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung (n = 3 Mäuse jedes Genotyps). **P < 0,01, ****P < 0,0001 (einfaktorielle ANOVA mit Tukeys Post-Hoc-Test). c Phasenkontrast-Mikroaufnahmen von primären Neuronen, die 10 Tage lang kultiviert wurden. Maßstabsbalken, 50 µm. d Vulkandiagramm für unterschiedlich exprimierte Gene in Chd8-CKO-Neuronen im Vergleich zu Kontrollneuronen unter der 5 mM KCl-Bedingung, bestimmt durch RNA-seq-Analyse (n = 3 Mäuse jedes Genotyps, 1 Männchen und 2 Weibchen für Chd8-CKO-Mäuse und 2 Männchen und 1 Weibchen für Kontrollmäuse). Differenziell exprimierte Gene (FDR-bereinigter P-Wert von <0,05) werden rot hervorgehoben. e GO-Analyse von Genen, deren Expression in Chd8-CKO-Neuronen hochreguliert (360 Gene) oder herunterreguliert (509 Gene) war. f SynGO-Analyse von Genen, deren Expression in Chd8-CKO-Neuronen herunterreguliert wurde (509 Gene). g GSEA für KEGG-Signalwege in Chd8-CKO-Neuronen im Vergleich zu Kontrollneuronen unter der 5 mM KCl-Bedingung. NES, normalisierter Anreicherungsscore.

Die durch einen Anstieg der extrazellulären KCl-Konzentration vermittelte neuronale Depolarisation induziert die Expression aktivitätsabhängiger Gene23. Als nächstes untersuchten wir daher, ob die Induktion der Genexpression als Reaktion auf neuronale Aktivität durch Chd8-Ablation in kultivierten postmitotischen Neuronen verändert wird. Kontrollneuronen, die 2 Stunden lang mit 55 mM KCl behandelt wurden, zeigten einen signifikanten Anstieg der Expression aktivitätsabhängiger Gene wie Arc, Egr1, Fos, Fosb, Npas4 und Nr4a1 im Vergleich zu denen, die mit 5 mM KCl behandelt wurden (Abb. 2a, Ergänzung). Tabelle 2). Die maximale mRNA-Häufigkeit trat für Egr1 nach ca. 1 Stunde und für Fosb und Nr4a1 nach ca. 2 Stunden auf, wobei die Mengen dieser mRNAs danach allmählich abnahmen (ergänzende Abbildung 3a – c). Bei mit 55 mM KCl behandelten Neuronen wurde die Expression von 775 Genen herunterreguliert und die von 404 Genen durch Chd8-Ablation hochreguliert (FDR-bereinigter P <0, 05) (Abb. 2b, Ergänzungstabelle 3). Unter diesen unterschiedlich exprimierten Genen war die Expression aktivitätsabhängiger Gene – einschließlich Egr1, Fosb und Nr4a1 – in Chd8-CKO-Neuronen signifikant herunterreguliert (Abb. 2b, c). Die Immunblot-Analyse bestätigte, dass die aktivitätsabhängige Expression von FOSB auf Proteinebene in Chd8-CKO-Neuronen im Vergleich zu Kontrollneuronen signifikant abgeschwächt war (ergänzende Abbildung 3d – f). Wir untersuchten auch unsere RNA-seq-Daten für die 190 KCl-induzierten Gene mit einem log2 (fachen Wechsel) von >2,0, verbunden mit einem FDR-bereinigten P-Wert von <0,01 in Kontrollneuronen, die mit 55 mM KCl behandelt wurden, im Vergleich zu denen, die mit 5 mM KCl behandelt wurden mM KCl (Abb. 2a). GSEA ergab, dass die Expression dieser KCl-induzierten Gene in Chd8-CKO im Vergleich zu Kontrollneuronen unter der 55 mM KCl-Bedingung herunterreguliert war (Abb. 2d). Darüber hinaus ergaben die SynGO-Analyse und die GSEA für KEGG-Signalwege, dass Gene mit einer signifikant herunterregulierten Expression in Chd8-CKO-Neuronen im Vergleich zu Kontrollneuronen unter dieser Bedingung auch solche im Zusammenhang mit Synapsen und Ribosomen umfassten (ergänzende Abbildung 4a – c). Der Vergleich unterschiedlich exprimierter Gene (FDR-angepasster P <0, 05) zwischen Chd8-CKO und Kontrollneuronen unter den Bedingungen von 5 und 55 mM KCl zeigte, dass 227 hochregulierte und 426 herunterregulierte Gene durch 55 mM KCl-Behandlung spezifisch identifiziert wurden (Abb. 2e, ergänzende Abb . 4d–f, Ergänzungstabelle 4). Die GO-Analyse ergab, dass diese herunterregulierten Gene mit Genen angereichert waren, die mit „Transkription, DNA-gesteuert“, „mRNA-Verarbeitung“, „Entwicklung des Nervensystems“ und „zellulärer Reaktion auf Calciumionen“ zusammenhängen (Abb. 2f).

ein Vulkandiagramm für unterschiedlich exprimierte Gene in Neuronen, die aus Kontrollmäusen isoliert und mit 55 mM KCl im Vergleich zu 5 mM KCl behandelt wurden (n = 3 Mäuse pro Bedingung). Differenziell exprimierte Gene (FDR-bereinigter P-Wert von <0,05) werden rot hervorgehoben. b Vulkandiagramm für unterschiedlich exprimierte Gene in Chd8-CKO-Neuronen im Vergleich zu Kontrollneuronen unter der 55 mM KCl-Bedingung (n = 3 Mäuse jedes Genotyps, 1 Männchen und 2 Weibchen für Chd8-CKO-Mäuse und 2 Männchen und 1 Weibchen für Kontrollmäuse). Differenziell exprimierte Gene (FDR-bereinigter P-Wert von <0,05) werden rot hervorgehoben. c Wärmekarte, die die Expression aktivitätsabhängiger Gene in Chd8-CKO und Kontrollneuronen unter den Bedingungen von 5 und 55 mM KCl darstellt (n = 3 Mäuse für jede Bedingung). Differenziell exprimierte Gene in Chd8-CKO-Neuronen im Vergleich zu Kontrollneuronen unter der 55 mM KCl-Bedingung sind durch Sternchen gekennzeichnet. d GSEA-Diagramm der unterschiedlich exprimierten Gene unter den durch KCl induzierten Genen (hochregulierte Gene mit einem log2 (fachen Wechsel) von >2, verbunden mit einem FDR-bereinigten P-Wert von <0,01 in Neuronen von Kontrollmäusen, die mit 55 mM KCl behandelt wurden, im Vergleich zu den behandelten mit 5 mM KCl in a) für Chd8-CKO-Neuronen im Vergleich zu Kontrollneuronen unter der 55 mM KCl-Bedingung. NES, normalisierter Anreicherungsscore. e Venn-Diagramme, die die Überlappung zwischen Genen zeigen, deren Expression in Chd8-CKO-Neuronen im Vergleich zu Kontrollneuronen unter den Bedingungen von 5 und 55 mM KCl hoch- oder herunterreguliert war. f GO-Analyse von Genen, deren Expression spezifisch hochreguliert (227 Gene) oder herunterreguliert (426 Gene) in Chd8-CKO-Neuronen war, die mit 55 mM KCl behandelt wurden, wie in e angegeben. Die Signifikanzniveaus für die Werte von P und FDR q werden durch * für <0,05, ** für <0,01, *** für <0,001 und **** für <0,0001 angegeben.

Angesichts der Rolle von CHD8 als Chromatin-Remodellierungsfaktor führten wir einen Assay für die Transposase-zugängliche Chromatin (ATAC)-seq-Analyse durch, um die genomweite Zugänglichkeit von Chromatin in Chd8-CKO- und Kontrollneuronen nach zweistündiger Behandlung mit 5 oder 55 mM KCl zu bewerten . Die meisten ATAC-seq-Peaks (50,2 bis 78,2 % der Gesamtpeaks) wurden auf diese vier Bedingungen verteilt (Abb. 3a). Heatmap- und Dichteprofile rund um hochvertrauenswerte CHD8-Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)-seq-Peaks zuvor veröffentlichter Daten12 zeigten ähnliche Verteilungsmuster der ATAC-seq-Signalintensität zwischen Chd8-CKO und Kontrollneuronen (Abb. 3b, ergänzende Abb. 5a). Wir untersuchten auch die Zugänglichkeit von Chromatin an Orten mehrerer aktivitätsabhängiger Gene, einschließlich Fosb, Nr4a1, Homer1 und Egr3, die alle in Chd8-CKO-Neuronen im Vergleich zu Kontrollneuronen unter der 55 mM KCl-Bedingung herunterreguliert waren. An oder in der Nähe dieser Genomorte wurden CHD8-Peaks nachgewiesen, die mit zugänglichen Chromatinstellen überlappten (Abb. 3c). Obwohl die Signalintensität mehrerer ATAC-seq-Peaks in diesen Regionen als Reaktion auf neuronale Aktivität zunahm, waren die Signalverteilungsmuster für die beiden Genotypen ähnlich (Abb. 3c, ergänzende Abb. 5b). Darüber hinaus führten wir eine ChIP-quantitative Polymerase-Kettenreaktionsanalyse (qPCR) durch, um die Auswirkungen der Chd8-Deletion auf die Häufigkeit von trimethyliertem Lys4 von Histon H3 (H3K4me3) und die Rekrutierung von RNA-Polymerase II zu untersuchen. Das Ausmaß der H3K4me3- oder RNA-Polymerase-II-Anreicherung um die Transkriptionsstartstelle (TSS) mehrerer aktivitätsabhängiger Gene war unter der 55 mM KCl-Bedingung in Chd8-CKO-Neuronen tendenziell höher als in Kontrollneuronen, diese Unterschiede erreichten jedoch keine statistische Signifikanz (Abb. 3d, e).

ein Venn-Diagramm, das die Überlappung zwischen ATAC-seq-Peaks zeigt, die in Chd8-CKO oder Kontrollneuronen nachgewiesen wurden, die aus männlichen Mäusen isoliert und 5 oder 55 mM KCl ausgesetzt wurden (n = 2 Mäuse pro Bedingung). Für die Analyse wurden zusammengeführte Daten für zwei unabhängige ATAC-seq-Replikate für jede Bedingung verwendet. Die separaten Ergebnisse der beiden Replikate für jede Bedingung sind in der ergänzenden Abbildung 5 dargestellt. b Gruppierung der Signaldichte und Wärmekarten der ATAC-seq-Peaks in der Region, die 3 kb stromaufwärts bis 3 kb stromabwärts des Zentrums der CHD8-Bindungspeaks umfasst. CHD8 ChIP-seq-Daten stammen aus einer früheren Studie12. c ATAC-seq-, CHD8 ChIP-seq- und RNA-seq-Daten für repräsentative aktivitätsabhängige Gene, angezeigt im Integrative Genomics Viewer-Browser. Die gelb schattierten Bereiche zeigen deutliche überlappende ATAC-seq- und ChIP-seq-Peaks an. d, e ChIP-qPCR-Analyse wurde für die H3K4me3-Ablagerung (d) und die RNA-Polymerase-II-Bindung (e) in der TSS-Region der angegebenen aktivitätsabhängigen Gene (oder in der Upstream-Region von Homer1, die als Negativkontrolle untersucht wurde) im Hippocampus durchgeführt Neuronen, die aus Chd8-CKO- oder Kontrollmäusen isoliert und 2,0 Stunden lang mit 55 mM KCl behandelt wurden. ChIP wurde mit normalem Immunglobulin G (IgG) als Kontrolle für die Antikörper gegen H3K4me3 oder gegen RNA-Polymerase II durchgeführt. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung (n = 3 unabhängige Experimente). Die P-Werte wurden mit dem ungepaarten Student-t-Test ermittelt.

Als nächstes erzeugten wir Mäuse mit CHD8-Mangel im Erwachsenenalter (im Folgenden als Chd8-CKO-Mäuse bezeichnet), indem wir 8 bis 12 Wochen alten CAG-CreER/Chd8F/F-Mäusen an fünf aufeinanderfolgenden Tagen intraperitoneal Tamoxifen verabreichten. Wir haben bestätigt, dass die floxierten (F) Allele von Chd8 im Hippocampus von Chd8-CKO-Mäusen effizient gelöscht wurden, was sich im Verlust der Chd8-Expression auf mRNA- und Proteinebene widerspiegelt (Abb. 4a, ergänzende Abb. 6a, b). Um zu untersuchen, ob CHD8 die Expression aktivitätsabhängiger Gene in vivo reguliert, induzierten wir durch Injektion des Glutamatrezeptor-Agonisten KA eine weit verbreitete neuronale Aktivität im Gehirn von Chd8-CKO- und Kontrollmäusen. Obwohl wir nach KA-Behandlung keinen signifikanten Unterschied in der Anfallsschwere zwischen Chd8-CKO- und Kontrollmäusen feststellen konnten (Abb. 4b), war die Expression aktivitätsabhängiger Gene, einschließlich Fosb, Nr4a1 und Egr1 im Hippocampus, bei Chd8-CKO-Mäusen signifikant herunterreguliert im Vergleich zu Kontrollmäusen mit einem ähnlichen Anfallsstadium 60 Minuten nach der KA-Behandlung (Abb. 4c). Die Häufigkeit von FOSB-Protein war im Hippocampus von Chd8-CKO-Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen nach KA-Behandlung ebenfalls signifikant verringert (ergänzende Abbildung 6a, c). Um zu untersuchen, ob die Chd8-Ablation die Zugänglichkeit von Chromatin in vivo verändert, führten wir eine ATAC-seq-Analyse für den Hippocampus von Chd8-CKO- und Kontrollmäusen nach Vehikelbehandlung oder von Mäusen mit einem ähnlichen Anfallsstadium 60 Minuten nach der KA-Behandlung durch. Die meisten ATAC-seq-Peaks (51,6 bis 74,0 % der Gesamtpeaks) wurden auf diese vier Bedingungen verteilt (Abb. 4d). Wärmekarten- und Dichteprofile um CHD8-ChIP-seq-Peaks mit hoher Konfidenz zeigten eine geringfügige Abnahme der ATAC-seq-Signalintensität im Hippocampus von Chd8-CKO-Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen nach KA- oder Vehikelbehandlung (Abb. 4e, ergänzende Abb. 7a). Die Zugänglichkeit von Chromatin am Genkörper mehrerer aktivitätsabhängiger Gene, einschließlich Fosb, Nr4a1 und Egr1, wurde durch KA-Behandlung sowohl im Kontroll- als auch im Chd8-CKO-Hippocampus erhöht (Abb. 4f, ergänzende Abb. 7b). Darüber hinaus war die ATAC-seq-Signalintensität an diesen Orten im Hippocampus von Chd8-CKO-Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen nach KA-Behandlung verringert (Abb. 4f, ergänzende Abb. 7b). Diese Ergebnisse deuten somit darauf hin, dass CHD8 für die Transkription und Zugänglichkeit von Chromatin an aktivitätsabhängigen Genen in aktivierten Neuronen in vivo essentiell ist.

eine RT-qPCR-Analyse von Chd8-mRNA im Hippocampus von männlichen CAG-CreER/Chd8F/F- (Chd8 CKO) und Chd8F/F-Mäusen (Kontrolle) im Alter von 17 bis 18 Wochen nach Behandlung mit Tamoxifen an fünf aufeinanderfolgenden Tagen bei 8 bis 18 Wochen 12 Wochen alt (n = 6 Mäuse jedes Genotyps). b Zeitlicher Verlauf des Anfalls-Scores für 60 Minuten nach der KA-Injektion bei männlichen Chd8-CKO-Mäusen (n = 12) und Kontrollmäusen (n = 14) im Alter zwischen 16 und 18 Wochen (linkes Feld) oder Chd8-CKO-Mäusen (n = 18) und Kontrollmäusen (n = 16) weibliche Mäuse im Alter zwischen 13 und 18 Wochen (rechtes Feld). c RT-qPCR-Analyse der mRNA-Häufigkeit für die angegebenen aktivitätsabhängigen Gene im Hippocampus von mit Vehikel behandelten Chd8-CKO-Mäusen (n = 6), mit Vehikel behandelten Kontrollmäusen (n = 6) und mit KA behandelten Chd8-CKO-Mäusen (n = 9) und Kontrollmäuse, die im Alter von 16 bis 18 Wochen mit KA behandelt wurden (n = 7). Für diese Analyse wurden männliche Mäuse mit einem Anfallsstadium von 3 bis 5 untersucht. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung des d-Venn-Diagramms, das die Überlappung zwischen im Hippocampus von Chd8-CKO-Mäusen und Kontrollmäusen mit einem ähnlichen Anfallsstadium nachgewiesenen ATAC-seq-Peaks 60 Minuten nach KA- oder Vehikelbehandlung zeigt (n = 2 Mäuse pro Bedingung: 1 Männchen und 1 Männchen). 1 Weibchen für Chd8 CKO und Kontrollmäuse, behandelt mit KA, 2 Männchen für Chd8 CKO und Kontrollmäuse, behandelt mit Vehikel). Für die Analyse wurden zusammengeführte Daten für zwei unabhängige ATAC-seq-Replikate für jede Bedingung verwendet. Die separaten Ergebnisse für die beiden Replikate jeder Bedingung sind in der ergänzenden Abbildung 7 dargestellt. e Gruppierung der Signaldichte und Wärmekarten der ATAC-seq-Peaks in der Region, die 3 kb stromaufwärts bis 3 kb stromabwärts des Zentrums der CHD8-Bindungspeaks umfasst. f ATAC-seq-Signale repräsentativer aktivitätsabhängiger Gene, angezeigt im Browser Integrative Genomics Viewer. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 (ungepaarter Student-t-Test in (a), zweifaktorielle wiederholte ANOVA in (b) und einfaktorielle ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Test in (c)).

Angesichts der Tatsache, dass eine Fehlregulation der aktivitätsabhängigen Genexpression mit Gedächtnisbildung und psychiatrischen Störungen verbunden ist5,6, führten wir mehrere Verhaltenstests mit Chd8-CKO und männlichen und weiblichen Kontrollmäusen durch. Im Morris-Wasserlabyrinthtest zeigten die Versuche mit sichtbaren und versteckten Plattformen an fünf aufeinanderfolgenden Tagen, dass die Fluchtlatenz bei Chd8-CKO- und Kontrollmäusen ähnlich war (Abb. 5a). Nach dem Training in den Versuchen mit sichtbaren und versteckten Plattformen führten wir einen Sondenversuch durch, bei dem die versteckte Plattform aus dem Wasserlabyrinth entfernt wurde. Die Anzahl der Zielplattformkreuzungen unterschied sich nicht zwischen Chd8 CKO und männlichen oder weiblichen Kontrollmäusen (Abb. 5b). Die im Zielquadranten verbrachte Zeit war im Vergleich zu den anderen Quadranten sowohl für Chd8-CKO-Mäuse als auch für Kontrollmäuse signifikant länger (Abb. 5c), was auf normales Lernen und Gedächtnisbildung bei Chd8-CKO-Mäusen hindeutet.

a Latenzzeit zum Erreichen der sichtbaren und verborgenen Plattformen im Morris-Wasserlabyrinth-Test für männliche Chd8-CKO-Mäuse (n = 18) und Kontrollmäuse (n = 20) im Alter von 11 bis 15 Wochen (linkes Feld) oder für Chd8-CKO-Mäuse (n = 20). = 16) und Kontrollmäuse (n = 18) im Alter zwischen 11 und 16 Wochen (rechtes Feld). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung b, c. Anzahl der Zielüberquerungen (b) und in jedem Quadranten verbrachte Zeit (c) nach der Plattformentfernung am Tag 6 für den Sondenversuch des Morris-Wasserlabyrinthtests, der mit den Mäusen in (a) durchgeführt wurde. T, O, L und R repräsentieren den Zielquadranten, den gegenüberliegenden, den linken bzw. den rechten Quadranten. Der graue Kreis stellt die Zielplattform dar. Die Daten werden als Box-and-Whisker-Diagramme dargestellt, wobei der untere und obere Rand der Box das 25. bzw. 75. Perzentil angeben, der mittlere Balken den Median angibt und die Whisker Nicht-Ausreißer-Extreme anzeigen. **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 (zweifaktorielle wiederholte ANOVA (a), zweifaktorielle ANOVA (b) oder einfaktorielle ANOVA mit Tukeys Post-Hoc-Test ( C)).

Als nächstes untersuchten wir angstähnliches Verhalten und abnormales Sozialverhalten, das typisch für ASD-Modellmäuse ist, einschließlich CHD8-haploinsuffizienter Mäuse12,13,14,15. Die im Freilandtest zurückgelegte Gesamtstrecke unterschied sich nicht zwischen den Genotypen, was auf eine normale Bewegungsaktivität bei Chd8-CKO-Mäusen hindeutet (Abb. 6a). Während die in der Mitte des offenen Feldes verbrachte Zeit bei männlichen Chd8-CKO-Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen kürzer war, war die Zeit bei weiblichen Chd8-CKO-Mäusen ähnlich wie bei Kontrollmäusen (Abb. 6b). Wir konnten keinen Unterschied zwischen den Genotypen für die Zeit feststellen, die wir während des erhöhten Plus-Labyrinth-Tests in den offenen Armen verbrachten, oder für die Zeit, die wir während des Hell-Dunkel-Übergangstests im hellen Raum verbrachten (Abb. 6c, d). Männliche und weibliche Chd8-CKO-Mäuse zeigten ebenfalls ein normales Selbstpflegeverhalten (Abb. 6e). Weibliche, aber nicht männliche Chd8-CKO-Mäuse zeigten während des Tests der gegenseitigen sozialen Interaktion eine Verlängerung der Gesamtkontaktzeit (Abb. 6f). Die Anzahl der sozialen Kontakte während dieses Tests unterschied sich nicht zwischen Chd8-CKO- und Kontrollmäusen (Abb. 6g). Im Dreikammer-Soziabilitätstest zeigten sowohl Chd8-CKO- als auch Kontrolltiere eine signifikante Präferenz für eine neuartige Maus (Fremder 1) (Abb. 6h, i). Im Test zur sozialen Neuheitspräferenz zeigten sowohl Chd8-CKO-Mäuse als auch männliche Kontrollmäuse ebenfalls eine signifikante Präferenz für eine neuartige Maus (Fremder 2) gegenüber einer bekannten Maus (Fremder 1), wohingegen weibliche Mäuse beider Genotypen keine solche Präferenz zeigten ( Abb. 6j, k). Diese Ergebnisse legen daher nahe, dass die Chd8-Ablation im erwachsenen Gehirn selektive Auswirkungen auf Verhaltensmerkmale hat.

a, b Gesamte zurückgelegte Strecke (a) und im zentralen Bereich verbrachte Zeit (b) für den Freilandtest, der mit männlichen Chd8-CKO-Mäusen (n = 18) und Kontrollmäusen (n = 20) im Alter zwischen 14 und 16 Wochen durchgeführt wurde oder mit Chd8 CKO (n = 16) und weiblichen Kontrollmäusen (n = 18) im Alter zwischen 12 und 17 Wochen. c Zeit, die in den offenen Armen für den erhöhten Plus-Labyrinth-Test verbracht wurde, der mit männlichen Chd8-CKO-Mäusen (n = 18) und Kontrollmäusen (n = 20) im Alter von 15 bis 17 Wochen oder mit Chd8-CKO-Mäusen (n = 16) und der Kontrollgruppe durchgeführt wurde (n = 18) weibliche Mäuse im Alter zwischen 12 und 17 Wochen. d Zeit, die in der Lichtkammer für den Hell-Dunkel-Übergangstest verbracht wurde, der mit Chd8 CKO (n = 18) und männlichen Kontrollmäusen (n = 20) im Alter zwischen 14 und 17 Wochen oder mit Chd8 CKO (n = 16) und Kontrolle durchgeführt wurde (n = 18) weibliche Mäuse im Alter zwischen 12 und 17 Wochen. e Gesamtdauer der Selbstpflege während eines Zeitraums von 10 Minuten für männliche Chd8-CKO- (n = 16) und Kontrollmäuse (n = 17) im Alter zwischen 11 und 16 Wochen oder für Chd8-CKO- (n = 16) und Kontrollmäuse (n). = 18) weibliche Mäuse im Alter zwischen 13 und 18 Wochen. f, g Gesamtdauer der Kontakte (f) und Anzahl der Kontakte (g) für den sozialen Interaktionstest in einer neuartigen Umgebung, durchgeführt mit männlichen Chd8-CKO-Mäusen (n = 9) und Kontrollmäusen (n = 10) im Alter von 15 bis 17 Wochen oder mit Chd8 CKO (n = 7) und weiblichen Kontrollmäusen (n = 9) im Alter zwischen 12 und 17 Wochen. h, i Repräsentative Spuren für männliche Mäuse (h) und die in jedem Käfig verbrachte Zeit (i) für den Dreikammer-Soziabilitätstest, der mit männlichen Chd8-CKO-Mäusen (n = 18) und männlichen Kontrollmäusen (n = 20) im Alter von 16 bis 18 Wochen durchgeführt wurde oder mit Chd8 CKO (n = 16) und weiblichen Kontrollmäusen (n = 18) im Alter zwischen 13 und 17 Wochen. Maßstabsbalken, 5 cm. j, k Repräsentative Spuren für männliche Mäuse (j) und die in jedem Käfig verbrachte Zeit (k) für den Dreikammer-Präferenztest für soziale Neuheiten, der mit den Mäusen in h und i durchgeführt wurde. Maßstabsbalken, 5 cm. Die Daten werden als Box-and-Whisker-Diagramme dargestellt, wobei der untere und obere Rand der Box das 25. bzw. 75. Perzentil angeben, der mittlere Balken den Median angibt und die Whisker Nicht-Ausreißer-Extreme angeben (a–g, i, k). *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,0001 (zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Post-Hoc-Test (a–g) oder gepaartem Student-t-Test (i, k)).

Wir haben hier gezeigt, dass die homozygote Deletion von Chd8 in postmitotischen Mausneuronen die Expression aktivitätsabhängiger Gene verändert. Wir fanden auch heraus, dass die Chd8-Expression im erwachsenen Gehirn für die Anfallsanfälligkeit oder die Gedächtnisbildung im Morris-Wasserlabyrinth-Test nicht wesentlich ist, aber für die Transkription aktivitätsabhängiger Gene erforderlich ist, die mit KA-induzierten Anfällen verbunden sind. Unsere Daten liefern somit Einblicke in die Rolle von CHD8 bei aktivitätsabhängigen Transkriptionsreaktionen in postmitotischen Neuronen.

Es wurde bereits gezeigt, dass CHD8 die Proliferation und Differenzierung vieler Arten von Stamm- und Vorläuferzellen durch Transkriptionskontrolle reguliert18,19,20,21,24,25,26. Obwohl die Expression von Chd8 im erwachsenen Gehirn bestehen bleibt27, ist die funktionelle Rolle von CHD8 in postmitotischen Neuronen unklar. Unsere Ergebnisse zeigen nun, dass CHD8 als Reaktion auf neuronale Aktivität zur Transkriptionsregulation beiträgt. Die aktivitätsabhängige Genexpression vermittelt die synaptische Entwicklung und Plastizität, die dem Lernen und dem Gedächtnis zugrunde liegen6, und ihre Störung steht im Zusammenhang mit neuropsychiatrischen Störungen wie ASD5. Während wir in dieser Studie selektive Verhaltensstörungen, einschließlich erhöhtem angstähnlichem Verhalten im Freilandtest bei männlichen Chd8-CKO-Mäusen und abnormales Sozialverhalten bei weiblichen Chd8-CKO-Mäusen, festgestellt haben, zeigen heterozygote Chd8-Knockout-Mäuse Veränderungen in der synaptischen Übertragung, ASD-ähnliches Verhalten Phänotypen sowie Lern- und Gedächtnisdefizite12,13,14,15,28. Unsere Beobachtungen legen daher nahe, dass eine fehlerhafte aktivitätsabhängige Transkriptionsregulation durch CHD8 zu den neurologischen Phänotypen von Personen mit ASD im Zusammenhang mit CHD8-Mutationen beitragen kann. Zusätzlich zu den Veränderungen in der Expression aktivitätsabhängiger Gene stellten wir fest, dass mit der Translation verbundene Gene unter den herunterregulierten Genen in Chd8-CKO-Neuronen stark angereichert waren. Die lokale Translation in Neuronen versorgt Axone und Synapsen mit Proteinen, die für die synaptische Plastizität und neuronale Funktion erforderlich sind29. Eine Fehlregulation der Translation wurde bereits zuvor mit ASD-ähnlichen Phänotypen in Verbindung gebracht30. CHD8 trägt somit zur Transkriptionsregulation im Zusammenhang mit mehreren Prozessen bei, einschließlich Transkription, Translation und Entwicklung des Nervensystems, und eine fehlerhafte Regulation dieser Prozesse im Zusammenhang mit der CHD8-Mutation könnte der ASD-Pathogenese zugrunde liegen.

Neuronale Aktivität verändert dynamisch die zugängliche Chromatinlandschaft in Verbindung mit der aktivitätsabhängigen Genexpression im erwachsenen Gehirn31. Im Gegensatz dazu ergab unsere ATAC-seq-Analyse nur geringe Veränderungen in der Zugänglichkeit von Chromatin in kultivierten Neuronen, die einer erhöhten extrazellulären KCl-Konzentration ausgesetzt waren, ähnlich wie frühere Ergebnisse32. Diese Unterschiede in den Auswirkungen der neuronalen Aktivität auf die Zugänglichkeit von Chromatin können auf Unterschiede in den experimentellen Bedingungen zwischen Neuronen in vivo und solchen in Kultur zurückzuführen sein. Tatsächlich ergab unsere ATAC-seq-Analyse des Hippocampus von KA-behandelten Mäusen eine erhöhte Zugänglichkeit des Chromatins am Genkörper aktivitätsabhängiger Gene. In Übereinstimmung mit früheren Erkenntnissen, dass CHD8 die Übernahme offener Chromatinstrukturen in mehreren Zelltypen fördert 19, 20, 33, fanden wir heraus, dass die Chd8-Ablation im erwachsenen Gehirn die Zugänglichkeit von Chromatin an den Orten aktivitätsabhängiger Gene verringerte. Obwohl wir in vitro keine Veränderungen der Zugänglichkeit von Chromatin als Reaktion auf die Deletion von Chd8 feststellen konnten, was wahrscheinlich auf technische Einschränkungen zurückzuführen ist, ist es möglich, dass CHD8 in gewissem Maße auch die Zugänglichkeit von Chromatin in kultivierten Neuronen beeinflusst, eine Möglichkeit, die weitere Untersuchungen erfordert. Da CHD8 an die Promotorregion aktivitätsabhängiger Gene bindet, kann es die Zugänglichkeit des Chromatins an den regulatorischen Elementen dieser Gene fördern und dadurch deren aktivitätsabhängige Transkription erleichtern. Weitere Studien sind erforderlich, um die detaillierten Mechanismen der Transkriptionsregulation durch CHD8 zu klären.

CHD8-Haploinsuffizienz ist ein hochgradig durchdringender Risikofaktor für ASD, und die heterozygote Chd8-Mutation verleiht Mäusen ASD-ähnliche Verhaltensphänotypen7,12,13,14,15,16,17. Einige Personen mit ASD im Zusammenhang mit der CHD8-Mutation erleiden Anfälle7, wohingegen wir bei Chd8-CKO-Mäusen keine Veränderung der Anfallsanfälligkeit feststellen konnten. Abnormales Sozialverhalten, wie beispielsweise eine längere Gesamtkontaktzeit während des Tests zur gegenseitigen sozialen Interaktion, ist eines der reproduzierbaren Verhaltensmerkmale von Chd8-Mutantenmäusen12,13,16,17,21. Weibliche, aber nicht männliche Chd8-CKO-Mäuse zeigten in der vorliegenden Studie ein verändertes Sozialverhalten, was auf einen sexuell dimorphen Phänotyp hindeutet15. Darüber hinaus zeigten männliche Chd8-CKO-Mäuse im Freilandtest ein erhöhtes angstähnliches Verhalten, nicht jedoch im erhöhten Plus-Labyrinth-Test und im Hell-Dunkel-Übergangstest. Angst ist eines der Symptome von Personen mit ASD1,7, und heterozygote Chd8-Mutantenmäuse zeigen ebenfalls angstähnliches Verhalten12,13. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass CHD8 im erwachsenen Gehirn zur Kontrolle von Sozialverhalten und angstähnlichem Verhalten beitragen könnte.

Sexuell dimorphe Verhaltensphänotypen wurden bereits bei ASD-Modellmäusen, einschließlich Chd8-Mutantenmäusen, beobachtet15. Angesichts der Tatsache, dass Sexualhormone und Geschlechtschromosomen an geschlechtsspezifischen Verhaltensunterschieden beteiligt sind34, ist es möglich, dass die Chd8-Deletion die Spiegel der Sexualhormone oder die Expression ihrer Rezeptoren verändert. Genetischer Hintergrund, Alter und Mutationsunterschiede können auch sexuell dimorphe Verhaltensergebnisse beeinflussen35,36.

Wir verwendeten die CAG-CreER-Mauslinie, um eine Tamoxifen-induzierbare Chd8-Deletion in postmitotischen Mausneuronen in vitro und im erwachsenen Gehirn in vivo zu erreichen. Da diese Linie die Rekombination in allen Zelltypen vorantreibt und keine Zelltypspezifität zeigt, könnte die Chd8-Deletion nicht nur in postmitotischen Neuronen, sondern auch in Gliazellen und anderen Zellpopulationen die in dieser Studie beobachteten transkriptomischen, epigenetischen und Verhaltensänderungen beeinflussen. Weitere Studien sind erforderlich, um festzustellen, ob diese Veränderungen auf Veränderungen in postmitotischen Neuronen zurückzuführen sind.

Es wurde zuvor gezeigt, dass CHD8 eine dosisabhängige Rolle bei der Transkriptionsregulation und den Verhaltensphänotypen spielt33,37. Angesichts der Tatsache, dass die homozygote Deletion von Chd8 im erwachsenen Gehirn in der vorliegenden Studie zu Transkriptionsveränderungen und einigen Verhaltensdefiziten führte, ist es auch möglich, dass die heterozygote Chd8-Mutation ähnliche, aber weniger ausgeprägte Auswirkungen hat. Insgesamt zeigen die vorliegenden Ergebnisse eine Rolle von CHD8 bei der aktivitätsabhängigen Transkriptionsregulation in postmitotischen Neuronen und im erwachsenen Gehirn und liefern daher möglicherweise wichtige Einblicke in die molekularen Mechanismen, die der Pathogenese von ASD zugrunde liegen.

Die Erzeugung von Chd8F/F-Mäusen wurde bereits beschrieben12. Chd8F/F-Mäuse wurden mit heterozygoten CAG-CreER-Mäusen gekreuzt, um CAG-CreER/Chd8F/F-Mäuse zu produzieren24. Zur Induktion der Cre-vermittelten Rekombination in vivo wurde CAG-CreER/Chd8F/F-Mäusen im Alter von 8 bis 12 Wochen an fünf aufeinanderfolgenden Tagen Tamoxifen (2 mg pro Maus), gelöst in Maisöl, intraperitoneal injiziert. Eine Mehrfachbehandlung mit Tamoxifen führt im Vergleich zu einer Einzelbehandlung zu einer effizienteren Deletion von Flox-Allelen38. Mäuse wurden durch PCR-basierte Analyse genomischer DNA mit Primern für Chd8 (5'-CCCAAAAGACCAAATCAAACAAAC-3′, 5′-CCATAGGCTGAAGAACCGTAATTG-3′ und 5′-AGGCTTAGAAACCCGTCGAG-3′) und Cre (5′-AGGTTCGTTCACTCATGGA-3) genotypisiert ′ und 5′-TCGACCAGTTTAGTTACCC-3′). Alle Experimente wurden von der Tierethikkommission der Kanazawa-Universität genehmigt.

Primäre Neuronen wurden wie zuvor beschrieben aus dem Hippocampus männlicher und weiblicher Mäuse bei E18.5 isoliert, jedoch mit geringfügigen Modifikationen23,39. Die Bildung von Pyramidenneuronen ist in diesem Stadium fast abgeschlossen, und die Isolierung von Neuronen aus embryonalem Gewebe hat den Vorteil, dass das Gewebe leichter dissoziiert und die Kontamination mit Gliazellen und Fibroblasten minimiert wird. Kurz gesagt, das Gewebe wurde 20 Minuten lang bei 37 °C mit 0,25 % Trypsin-EDTA und DNase (047-26771, Wako) bei 25 µg/ml inkubiert und anschließend einer sanften Dissoziation durch wiederholtes Passieren durch eine Pasteurpipette unterzogen die Zugabe von Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und DNase (10 µg/ml). Dissoziierte Zellen wurden durch ein 40-μm-Zellsieb geleitet, durch Zentrifugation gesammelt und auf eine mit Poly-d-Lysin (P6407, Sigma-Aldrich) beschichtete Platte übertragen, um sie bei 37 ° C in neurobasalem Medium, ergänzt mit MACS NeuroBrew-21, zu kultivieren Nahrungsergänzungsmittel (130-097-263, Miltenyi Biotec) mit 20 ml/l, 2 mM L-Glutamin (25030081, Thermo Fisher Scientific) und Penicillin-Streptomycin (15140122, Thermo Fisher Scientific) mit 10 ml/l. Nach 2 Tagen in vitro (DIV) wurden die Kulturen 24 Stunden lang mit 1 µM Ara-C behandelt, um alle sich teilenden Zellen zu eliminieren. Zur Induktion der Cre-vermittelten Rekombination in vitro wurden Neuronen 24 Stunden lang in Gegenwart von 500 µM 4-OHT bei 4 DIV inkubiert. Für die KCl-induzierte neuronale Depolarisation wurden 1 µM Tetrodotoxin (Wako) und 100 µM D-AP5 (Tocris Bioscience) dem Kulturmedium bei 9 DIV zugesetzt, um die neuronale Aktivität zu reduzieren, und die Neuronen wurden dann 2 Stunden lang mit 5 oder 55 mM KCl behandelt h durch Zugabe von Kontrollpuffer (5 mM KCl, 165 mM NaCl, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mM MgCl2, 11 mM HEPES) oder Depolarisationspuffer (170 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mM MgCl2, 11 mM HEPES) zu einer endgültigen Verdünnung von 32,4 % bei 10 DIV.

Polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen CHD8 wurden intern erzeugt und für die Immunoblot-Analyse verwendet. Zu den weiteren Antikörpern zählten jene gegen TUBB3 (ab78078, Abcam, 1:500), gegen GFAP (IR524, DAKO, 1:500) und gegen Olig2 (AB9610, Millipore, 1:500) für die Immunfluoreszenzfärbung, jene gegen FOSB (ab184938, Abcam, 1:2000) und an HSP90 (610419, BD Biosciences, 1:2000) für die Immunblot-Analyse sowie an H3K4me3 (ab8580, Abcam, 2 µg pro Probe) und an RNA-Polymerase II (91151, Active Motif, 2 µg). pro Probe) für ChIP.

Die Immunfluoreszenzfärbung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt21. Die kultivierten Zellen wurden über Nacht bei 4 °C mit 4 % Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) fixiert, 2 % Rinderserumalbumin und 0,3 % Triton X-100 in PBS ausgesetzt und dann über Nacht bei 4 °C mit Primärzellen inkubiert Antikörper. Immunkomplexe wurden mit Alexa Fluor 488– oder Alexa Fluor 546–konjugierten Ziegen-Sekundärantikörpern (Thermo Fisher Scientific) nachgewiesen. Der TUNEL-Assay (Terminal Desoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick-End Labeling) wurde unter Verwendung eines MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct (8445, MBL) durchgeführt. Alle Zellen wurden mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) gegengefärbt und Bilder wurden mit einem BZ-X800-Mikroskop (Keyence) aufgenommen. Die ImageJ-Software wurde verwendet, um die Anzahl der einzelnen Zelltypen oder apoptotischen Zellen zu zählen.

Gesamt-RNA (500 ng), die unter Verwendung des TRIzol-Reagenzes (Thermo Fisher Scientific) aus kultivierten Neuronen oder dem Hippocampus isoliert wurde, wurde einer RT mit ReverTra Ace RT-Mischung mit gDNA-Entferner (Toyobo) unterzogen. Die resultierende cDNA wurde einer Echtzeit-PCR-Analyse unter Verwendung von Luna Universal qPCR Master Mix (M3003, New England Biolabs) und spezifischen Primern in einem Thermal Cycler Dice Real Time System III (Takara Bio) unterzogen. Die Daten wurden anhand der Häufigkeit von Rplp0- oder Gapdh-mRNA normalisiert. Die PCR-Primer (sense bzw. antisense) waren wie folgt: Rplp0, 5'-GGACCCGAGAAGACCTCCTT-3' und 5'-GCACATCACTCAGAATTTCAATGG-3'; Gapdh, 5'-GCCTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3' und 5'-GAGTGGGAGTTGCTGTTGAAGTCG-3'; Chd8L, 5'-TCCCTTTTTGGTCATTGCTC-3' und 5'-TTCAGCCTATGGGCTTCATC-3'; Fosb, 5'-TTTTCCCGGAGACTACGACTC-3' und 5'-GTGATTGCGGTGACCGTTG-3'; Nr4a1, 5′-TTGAGTTCGGCAAGCCTACC-3′ und 5′-GTTGTACCCGTCCATGAAGGTG-3′; und Egr1, 5'-TCGGCTCCTTTCCTCACTCA-3' und 5'-CTCATAGGGTTGTTCGCTCGG-3'.

Gesamtproteinextrakte wurden aus kultivierten Neuronen oder dem Hippocampus hergestellt und wie zuvor beschrieben einer Immunoblot-Analyse unterzogen40. Die ImageJ-Software wurde verwendet, um die Signalintensität für jedes Protein zu messen.

Die Gesamt-RNA wurde aus Neuronen extrahiert, die mit 5 oder 55 mM KCl unter Verwendung des TRIzol-Reagenzes behandelt wurden. Messenger-RNA (1 μg), die mithilfe eines NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module (New England Biolabs) aus der Gesamt-RNA gereinigt wurde, wurde zur Herstellung einer cDNA-Bibliothek mithilfe eines NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit verwendet für Illumina (New England Biolabs) und jede Bibliothek wurde dann unter Verwendung eines NovaSeq 6000-Systems (Illumina) sequenziert. Die Qualität der Rohsequenzierungsdaten wurde mit FastQC (Version 0.11.9) überprüft und das Trimmen der Adaptersequenzen wurde mit Trimmomatic (Version 0.39)41 durchgeführt. Die Gesamtmenge jeder mRNA wurde mithilfe einer Reihe von Programmen berechnet, darunter HISAT2 (Version 2.1.0)42, featureCounts (Version 2.0.0)43 und DESeq2 (Version 1.26.0)44. RNA-seq-Reads wurden gegen das Mausgenom (mm10) kartiert. GSEA wurde wie zuvor beschrieben unter Verwendung der GSEA-Softwareversion 4.2.145 durchgeführt. Für GSEA wurde ein Satz von Genen verwendet, deren Expression in mit 55 mM KCl behandelten Kontrollneuronen im Vergleich zu denen, die mit 5 mM KCl behandelt wurden, signifikant hochreguliert war (log2 (fache Änderung) von > 2,0 verbunden mit einem FDR-angepassten P-Wert von <0,01). . Die GO-Analyse unterschiedlich exprimierter Gene (FDR q <0,05) wurde unter Verwendung von DAVID46 und SynGO47 durchgeführt.

ATAC-seq-Bibliotheken wurden mit einem ATAC-Seq-Kit (Active Motif) erstellt. Aus männlichen Mäusen isolierte Chd8-CKO- und Kontrollneuronen wurden 2 Stunden lang mit 5 oder 55 mM KCl behandelt und dann 30 Minuten lang bei 37 °C in Kulturmedium mit DNase (15 µg/ml) inkubiert. Anschließend wurden die Neuronen durch Einwirkung von 0,25 % Trypsin-EDTA von der Kulturplatte dissoziiert. Der Hippocampus wurde 60 Minuten nach der KA- oder Vehikelbehandlung manuell vom Gehirn von Mäusen jedes Genotyps mit einem ähnlichen Anfallsstadium getrennt. Kerne wurden aus den kultivierten Zellen oder dem Hippocampus unter Verwendung von ATAC-Lysepuffer extrahiert, und 1 × 105 Kerne wurden zur Herstellung jeder ATAC-seq-Bibliothek verwendet. Die Bibliotheken wurden unter Verwendung eines HiSeq 2500-Systems (Illumina) sequenziert. Die Lesevorgänge wurden mithilfe der Bowtie-Software (Version 2.2.3)48 eindeutig dem Mausgenom (mm10) zugeordnet, und doppelte Lesevorgänge wurden mit samtools (Version 1.9)49 entfernt. BAM-Dateien für zwei Replikate für jede Bedingung wurden mit samtools zusammengeführt. Deutlich angereicherte Regionen des Genoms wurden mit dem MACS Peak Caller (Version 2.1.1, mit der Option „-p 1e−5 --gsize mm --nomodel --extsize 160“) identifiziert50. Heatmap- und Dichteprofile wurden mit plotHeatmap in deepTools (3.5.0)51 erstellt.

ChIP wurde im Wesentlichen wie zuvor beschrieben21 durchgeführt. Kultivierte Neuronen, die 2 Stunden lang mit 55 mM KCl behandelt wurden, wurden durch 10-minütige Inkubation auf Eis mit 0,5 % Paraformaldehyd in ChIP-Puffer (5 mM HEPES-KOH (pH 8,0), 200 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1,5 mM MgCl2, 5) fixiert % Saccharose, 0,5 % Nonidet P-40), ergänzt mit einem Protease-Inhibitor-Cocktail (Wako), einer Ultraschallbehandlung unterzogen und 40 Minuten lang bei 30 °C mit Mikrokokken-Nuklease verdaut. Nach der Zugabe von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM wurde jede verdaute Probe 10 Minuten lang bei 4 °C und 15.000 × g zentrifugiert, und der resultierende Überstand wurde unter Rotation 6 Stunden lang bei 4 °C mit magnetisch konjugierten Antikörpern inkubiert Perlen. Gebundene Proteine ​​wurden von den Perlen eluiert und die Vernetzungen wurden durch Inkubation über Nacht bei 65 °C mit 1 % SDS in Tris-EDTA-Puffer rückgängig gemacht. Nach zweimaligem Waschen sowohl mit ChIP-Puffer als auch mit Tris-EDTA-Puffer wurde die DNA mit Nucleo Spin Gel und PCR Clean-Up (Takara Bio) gereinigt und wie oben beschrieben einer Echtzeit-PCR-Analyse unterzogen. PCR-Primer (sense bzw. antisense) waren wie folgt: Egr3 TSS, 5'-GGAAGGCTTGGTTGGAGAC-3' und 5'-GCACCTACCTCCCTCCAGTC-3'; Fosb TSS, 5'-AGCCTGGACTTTCAGGAGGT-3' und 5'-GCTCGGGGAAGCTTAGTCTC-3'; Nr4a1 TSS, 5′-AACCTGCACTGGGGTATCAC-3′ und 5′-GACAAAGCTTGGCTTCCTTG-3′; Homer1 TSS, 5'-GCCTTTAGGAGGGGAGAAAG-3' und 5'-GGGGAAAACCACCGTTAAT-3'; und Homer1 stromaufwärts, 5'-TCTGCCACCTCATTTCTGCT-3' und 5'-TAGCACACACAGGCCATCAT-3'.

Die zuvor mit Antikörpern gegen CHD8 (DRA003116) erhaltenen ChIP-seq-Daten wurden wie in der ursprünglichen Studie12 beschrieben erneut analysiert. Kurz gesagt, die Lesevorgänge wurden mithilfe der Bowtie-Software (Version 2.2.3)48 eindeutig dem Mausgenom (mm10) zugeordnet und doppelte Lesevorgänge wurden mit Samtools (Version 1.9)49 entfernt. Deutlich angereicherte Regionen des Genoms wurden mit dem MACS Peak Caller (Version 2.1.1, mit der Option „-p 1e−5 --gsize mm --nomodel --extsize 160“) identifiziert50.

Männlichen Mäusen im Alter von 16 bis 18 Wochen und weiblichen Mäusen im Alter von 13 bis 18 Wochen wurde KA (25 mg/kg), gelöst in PBS, intraperitoneal injiziert. Die Auslösung von Anfällen durch KA ist eines der am häufigsten untersuchten Modelle der Temporallappenepilepsie52. Verhaltensanfälle wurden 1 Stunde nach der Injektion beobachtet und gemäß den zuvor beschriebenen Kriterien53 bewertet: Stadium 0, normales Verhalten; Stufe 1, Immobilität und Starrheit; Stufe 2, Kopfwippen; Stadium 3, Klonus der Vorderbeine und Aufzucht; Stufe 4, kontinuierliches Aufrichten und Fallen; Stadium 5, klonisch-tonischer Anfall; Stufe 6, Tod. Anschließend wurde der Hippocampus entnommen, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und zur Analyse der Genexpression bei –80 °C gelagert. Für die Genexpressionsanalyse und die ATAC-seq-Analyse wurden Mäuse mit einem Anfallsstadium von 3 bis 5 verwendet.

Chd8-CKO- oder Kontrollmäuse wurden in Gruppen in einem Raum mit einem 12-Stunden-Licht- und 12-Stunden-Dunkel-Zyklus (Licht an um 8:00 Uhr) und mit Zugang zu Futter und Wasser nach Belieben gehalten. Verhaltenstests wurden mit männlichen und weiblichen Mäusen im Alter von 11 bis 18 Wochen und zwischen 9:00 und 18:00 Uhr durchgeführt, wie zuvor beschrieben19. Jedes Gerät wurde vor dem Test jedes Tieres mit einer verdünnten Natriumhypochloritlösung gereinigt, um eine Verzerrung aufgrund von Geruchssignalen zu verhindern. Zu den Verhaltenstests gehörten der Morris-Wasserlabyrinth-Test, der Freifeldtest, der Hell-Dunkel-Übergangstest, der erhöhte Plus-Labyrinth-Test, der Selbstpflegetest, der Test zur sozialen Interaktion in einer neuartigen Umgebung sowie Tests zur Geselligkeit und zur Präferenz für soziale Neuheiten. Alle Tests wurden von gut ausgebildeten Experimentatoren unter Verwendung automatisierter Analysesysteme wie unten beschrieben durchgeführt. Um Verzerrungen bei Verhaltensmessungen auszuschließen, waren die Experimentatoren stets blind für den Maus-Genotyp.

Für Versuche mit sichtbaren und versteckten Plattformen des Morris-Wasserlabyrinthtests wurde ein kreisförmiges Plastikbecken (120 cm Durchmesser) bis zu einer Tiefe von 30 cm mit Wasser (bei 21 ° ± 1,0 °C gehalten) gefüllt, das weiß gefärbt war die Zugabe ungiftiger Farbe54. Eine transparente kreisförmige Fluchtplattform (9 cm Durchmesser) wurde in der Mitte eines der Beckenquadranten eingetaucht, wobei ihre Oberfläche etwa 1 cm unter der des Wassers lag. Visuelle Hinweise, die sich in geometrischer Form und Farbe unterschieden, wurden rund um den Pool verteilt. Männliche Mäuse im Alter zwischen 11 und 15 Wochen und weibliche Mäuse im Alter zwischen 11 und 16 Wochen wurden zunächst der Aufgabe „Sichtbare Plattform“ unterzogen, bei der die Plattform mit einer Flagge markiert wurde. Am nächsten Tag wurde die Flagge entfernt und die Aufgaben der versteckten Plattform wurden an vier aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt. Die Maus wurde in jedem der vier Quadranten zufällig mit Blick auf die Wand im Becken platziert. Jede Aufgabe bestand aus vier Versuchen pro Tag mit einer Cutoff-Zeit von 60 Sekunden. Wenn die Maus die Zielplattform erreichte, durfte sie >15 s auf der Plattform bleiben. Wenn die Maus die Plattform nicht innerhalb von 60 s fand, wurde sie vorsichtig dorthin geführt und dann dort für > 15 s belassen. Am 6. Tag wurde die Plattform aus dem Pool entfernt und ein Sondenversuch durchgeführt, um die Erinnerung an den vorherigen Standort der Plattform zu ermitteln. Den Mäusen wurde erlaubt, 60 Sekunden lang im Becken zu schwimmen, und die Zeit, die sie in jedem Quadranten verbrachten, wurde gemessen. Die Fortbewegung der Maus wurde mit einer Videokamera aufgezeichnet und automatisch mit der SMART Video Tracking-Software (Panlab) analysiert.

Jede männliche Maus im Alter von 14 bis 16 Wochen oder weibliche Maus im Alter von 12 bis 17 Wochen wurde in die Ecke eines Freilandapparats (50 x 50 x 40 cm, O'Hara & Co.) gestellt, der beleuchtet war bei 100 Lux. Die zurückgelegte Gesamtstrecke und die im zentralen Bereich (25 x 25 cm) verbrachte Zeit wurden über einen Zeitraum von 10 Minuten aufgezeichnet. Die Fortbewegung der Maus wurde mit einer Videokamera aufgezeichnet, die mit einem maßgeschneiderten Programm in LabVIEW gesteuert wurde, und automatisch mit hauseigener, in Python geschriebener Software analysiert.

Der Apparat bestand aus zwei offenen Armen (25 x 5 cm) und zwei geschlossenen Armen gleicher Größe mit 15 cm hohen transparenten Wänden (O'Hara & Co.). Die Arme und das zentrale Quadrat bestanden aus weißen Kunststoffplatten und wurden auf eine Höhe von 50 cm über dem Boden erhöht. Die Wahrscheinlichkeit, dass Tiere aus dem Gerät fallen, wurde durch das Vorhandensein von 3 mm hohen Kunststoffleisten an den offenen Armen minimiert. Arme des gleichen Typs waren auf gegenüberliegenden Seiten angeordnet. Jede männliche Maus im Alter von 15 bis 17 Wochen oder weibliche Maus im Alter von 12 bis 17 Wochen wurde im zentralen Quadrat des Labyrinths (5 x 5 cm) mit Blick auf einen der geschlossenen Arme platziert und ihr Verhalten wurde über 10 Minuten aufgezeichnet . Die Fortbewegung der Maus wurde mit einer Videokamera aufgezeichnet, die mit einem maßgeschneiderten Programm in LabVIEW gesteuert wurde, und die in den offenen Armen verbrachte Zeit wurde automatisch mit einer hauseigenen, in Python geschriebenen Software gemessen.

Der Apparat bestand aus einem Käfig (21 x 42 x 25 cm), der durch eine Trennwand mit Tür (O'Hara & Co.) in zwei gleich große Abschnitte unterteilt war. Eine Kammer bestand aus weißem Kunststoff und war hell beleuchtet (390 Lux), während die andere schwarz und dunkel war (2 Lux). Männliche Mäuse im Alter von 14 bis 17 Wochen oder weibliche Mäuse im Alter von 12 bis 17 Wochen wurden auf die dunkle Seite gelegt und konnten sich bei geöffneter Tür 10 Minuten lang frei zwischen den beiden Kammern bewegen. Die Fortbewegung der Maus wurde mit einer Videokamera aufgezeichnet, die mit einem maßgeschneiderten Programm in LabVIEW gesteuert wurde, und die in jeder Kammer verbrachte Zeit wurde automatisch mit einer in Python geschriebenen hauseigenen Software gemessen.

Der Pflegetest wurde wie zuvor beschrieben12 durchgeführt. Jede männliche Maus im Alter von 11 bis 16 Wochen oder weibliche Maus im Alter von 13 bis 18 Wochen wurde einzeln in einen neuen Standardkäfig gesetzt. Nach 10-minütiger Gewöhnung wurde das Tier für einen 10-minütigen Testzeitraum auf Video aufgezeichnet und die Zeit, die es für das Fellpflegeverhalten aufwendete, wurde bestimmt.

Zwei Mäuse im Alter von 15 bis 17 Wochen für Männer und 12 bis 17 Wochen für Frauen und vom gleichen Genotyp, die zuvor in Gruppen gemischter Genotypen (drei oder vier Tiere pro Käfig) und in verschiedenen Käfigen gehalten wurden, wurden zusammengebracht in eine Box (50 x 50 x 40 cm, O'Hara & Co.) gelegt und 10 Minuten lang frei erkundet. Die Bilder wurden mit einer Geschwindigkeit von drei Bildern pro Sekunde aufgenommen und die Analyse wurde automatisch mit einer in Python geschriebenen hauseigenen Software durchgeführt. Gemessen wurden die Gesamtzahl der Kontakte und die Gesamtdauer der Kontakte.

Die Testapparatur bestand aus einem rechteckigen Dreikammerkasten (O'Hara & Co.). Jede Kammer war 20 x 40 x 30 cm groß und die Trennwände bestanden aus klarem Plexiglas mit kleinen Öffnungen (6 cm), die den Zugang in jede Kammer ermöglichten. Eine unbekannte Maus gleichen Geschlechts (Fremder 1), die zuvor keinen Kontakt mit der Versuchsmaus hatte, wurde in eine der Seitenkammern gesetzt. Die Position von Fremder 1 in der linken und rechten Kammer wurde zwischen den Versuchen systematisch abgewechselt. Die fremde Maus war in einem kleinen runden Drahtkäfig eingeschlossen, der Nasenkontakt zwischen den Gitterstäben ermöglichte, aber Kämpfe verhinderte. Der Käfig war 10 cm hoch, hatte einen Bodendurchmesser von 10 cm und einen Abstand der vertikalen Stangen von 0,5 cm. In der anderen Seitenkammer wurde ein identischer leerer Käfig platziert. Die Versuchsmaus wurde zunächst in die mittlere Kammer gelegt und durfte 10 Minuten lang die gesamte soziale Testbox erkunden. Mithilfe einer Kamera wurde die Zeit gemessen, die die Tiere rund um jeden Käfig und in jeder Kammer verbrachten, um die soziale Präferenz für Fremder 1 zu quantifizieren. Anschließend wurde eine zweite unbekannte Maus gleichen Geschlechts (Fremder 2) in den leeren Käfig gesetzt. Die Testmaus hatte somit die Wahl zwischen der ersten, bereits untersuchten unbekannten Maus (Fremder 1) und der neuartigen unbekannten Maus (Fremder 2). Die Zeit, die während einer zweiten 10-minütigen Sitzung um jeden Käfig und in jede Kammer verbracht wurde, wurde wie zuvor gemessen. Als Fremdmäuse wurden C57BL/6J-Mäuse verwendet, und die in diesen Tests verwendeten männlichen und weiblichen Versuchsmäuse waren 16 bis 18 Wochen bzw. 13 bis 17 Wochen alt. Die Fortbewegung der Maus wurde mit einer Videokamera aufgezeichnet, die mit einem maßgeschneiderten Programm in LabVIEW gesteuert wurde, und automatisch mit hauseigener, in Python geschriebener Software analysiert.

Quantitative Daten werden als Mittelwert ± SEM oder wie angegeben dargestellt, wobei auch die Anzahl der Mäuse angegeben wird, die jedem Experiment unterzogen wurden. Die statistische Analyse mit dem ungepaarten Student-t-Test, dem gepaarten Student-t-Test, der einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukeys Post-hoc-Test, der zweifaktoriellen ANOVA oder der zweifaktoriellen wiederholten ANOVA wurde unter Verwendung der R-Sprache durchgeführt . Signifikanzniveaus für P- und FDR-q-Werte werden durch *, **, *** und **** für <0,05, <0,01, <0,001 bzw. <0,0001 angegeben.

Die allen Diagrammen zugrunde liegenden Quelldaten sind in den Zusatzdaten 2 verfügbar. Daten sind durch Kontaktaufnahme mit dem entsprechenden Autor erhältlich. Unbeschnittene Bilder der Immunoblots sind in der ergänzenden Abbildung 8 dargestellt. RNA-seq- und ATAC-seq-Daten wurden im DDBJ Sequence Read Archive (DRA) unter den Zugangsnummern DRA014131, DRA016165 und DRA016198 hinterlegt.

Lord, C., Elsabbagh, M., Baird, G. & Veenstra-Vanderweele, J. Autismus-Spektrum-Störung. Lancet 392, 508–520 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Tabuchi, K. et al. Eine mit Autismus in Zusammenhang stehende Neuroligin-3-Mutation erhöht die hemmende synaptische Übertragung bei Mäusen. Wissenschaft 318, 71–76 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Peca, J. et al. Shank3-Mutantenmäuse zeigen autismusähnliches Verhalten und striatale Dysfunktion. Natur 472, 437–442 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bourgeron, T. Von der genetischen Architektur zur synaptischen Plastizität bei Autismus-Spektrum-Störungen. Nat. Rev. Neurosci. 16, 551–563 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ebert, DH & Greenberg, ME Aktivitätsabhängige neuronale Signalübertragung und Autismus-Spektrum-Störung. Natur 493, 327–337 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Minatohara, K., Akiyoshi, M. & Okuno, H. Rolle unmittelbar früher Gene bei der synaptischen Plastizität und neuronalen Ensembles, die der Gedächtnisspur zugrunde liegen. Vorderseite. Mol. Neurosci. 8, 78 (2015).

PubMed Google Scholar

Bernier, R. et al. Disruptive CHD8-Mutationen definieren einen Subtyp von Autismus in einer frühen Entwicklungsphase. Zelle 158, 263–276 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Satterstrom, FK et al. Eine groß angelegte Exomsequenzierungsstudie impliziert sowohl entwicklungsbedingte als auch funktionelle Veränderungen in der Neurobiologie von Autismus. Zelle 180, 568–584 e523 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nishiyama, M. et al. CHD8 unterdrückt die p53-vermittelte Apoptose durch die Rekrutierung von Histon H1 während der frühen Embryogenese. Nat. Zellbiol. 11, 172–182 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sugathan, A. et al. CHD8 reguliert neurologische Entwicklungswege, die mit der Autismus-Spektrum-Störung bei neuronalen Vorläufern verbunden sind. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 111, E4468–E4477 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cotney, J. et al. Der Autismus-assoziierte Chromatin-Modifikator CHD8 reguliert andere Autismus-Risikogene während der menschlichen Neuroentwicklung. Nat. Komm. 6, 6404 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Katayama, Y. et al. CHD8-Haploinsuffizienz führt bei Mäusen zu autismusähnlichen Phänotypen. Natur 537, 675–679 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Platt, RJ et al. Chd8-Mutation führt zu autismusähnlichem Verhalten und beeinträchtigten striatalen Schaltkreisen. Cell Rep. 19, 335–350 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gompers, AL et al. Keimbahn-Chd8-Haploinsuffizienz verändert die Gehirnentwicklung bei Mäusen. Nat. Neurosci. 20, 1062–1073 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jung, H. et al. Sexuell dimorphes Verhalten, neuronale Aktivität und Genexpression bei Chd8-mutierten Mäusen. Nat. Neurosci. 21, 1218–1228 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Suetterlin, P. et al. Veränderte neokortikale Genexpression, Gehirnüberwucherung und funktionelle Überkonnektivität bei chd8-haploinsuffizienten Mäusen. Großhirn. Cortex 28, 2192–2206 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Jimenez, JA et al. Chd8-Haploinsuffizienz beeinträchtigt die frühe Gehirnentwicklung und die Proteinhomöostase im späteren Leben. Mol. Autismus 11, 74 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kweon, H. et al. Erregendes neuronales CHD8 bei der Regulierung der neokortikalen Entwicklung und des sensomotorischen Verhaltens. Cell Rep. 34, 108780 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kawamura, A. et al. Das Autismus-assoziierte Protein CHD8 ist für die Entwicklung des Kleinhirns und die motorische Funktion erforderlich. Cell Rep. 35, 108932 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhao, C. et al. Doppelter Bedarf an CHD8 für die Etablierung der Chromatinlandschaft und die Rekrutierung von Histon-Methyltransferase zur Förderung der ZNS-Myelinisierung und -Reparatur. Entwickler Zelle 45, 753–768 e758 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Kawamura, A. et al. Eine Funktionsstörung der Oligodendrozyten aufgrund einer Chd8-Mutation führt bei Mäusen zu Verhaltensdefiziten. Summen. Mol. Genet. 29, 1274–1291 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kawamura, A. et al. Die Chd8-Mutation in Oligodendrozyten verändert die Mikrostruktur und die funktionelle Konnektivität im Gehirn der Maus. Mol. Gehirn 13, 160 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Flavell, SW et al. Genomweite Analyse des MEF2-Transkriptionsprogramms enthüllt synaptische Zielgene und eine von der neuronalen Aktivität abhängige Auswahl der Polyadenylierungsstelle. Neuron 60, 1022–1038 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kita, Y. et al. Das Autismus-bezogene Protein CHD8 kooperiert mit C/EBPbeta, um die Adipogenese zu regulieren. Cell Rep. 23, 1988–2000 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nita, A. et al. Das mit Autismus in Zusammenhang stehende Protein CHD8 trägt zur Stammzellbildung und Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen der Maus bei. Cell Rep. 34, 108688 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tu, Z. et al. Der Chromatin-Remodeler CHD8 steuert das Überleben des hämatopoetischen Stamms/Vorläufers, indem er die ATM-vermittelte Stabilität des P53-Proteins reguliert. Blut 138, 221–233 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, Q. et al. Ein mit Autismus verbundener CHD8-Mangel beeinträchtigt die Axonentwicklung und die Migration kortikaler Neuronen. Mol. Autismus 9, 65 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ellingford, RA et al. Zelltypspezifisches synaptisches Ungleichgewicht und gestörte homöostatische Plastizität in kortikalen Schaltkreisen von ASD-assoziierten Chd8-haploinsuffizienten Mäusen. Mol. Psychiatrie 26, 3614–3624 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu-Yesucevitz, L. et al. Lokale RNA-Translation an der Synapse und bei Krankheiten. J. Neurosci. 31, 16086–16093 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gkogkas, CG et al. Autismusbedingte Defizite durch dysregulierte eIF4E-abhängige Translationskontrolle. Natur 493, 371–377 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Su, Y. et al. Neuronale Aktivität verändert die Zugänglichkeit von Chromatin im erwachsenen Gehirn. Nat. Neurosci. 20, 476–483 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, B. et al. Durch neuronale Aktivität induzierte BRG1-Phosphorylierung reguliert die Enhancer-Aktivierung. Cell Rep. 36, 109357 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sood, S. et al. Die CHD8-Dosierung reguliert die Transkription der Pluripotenz und die frühe neuronale Differenzierung der Maus. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 117, 22331–22340 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cox, KH & Rissman, EF Geschlechtsunterschiede im Sozialverhalten juveniler Mäuse werden durch Geschlechtschromosomen und den sozialen Kontext beeinflusst. Gene Gehirnverhalten. 10, 465–472 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lee, SY, Kweon, H., Kang, H. & Kim, E. Altersdifferenzieller Sexualdimorphismus im Verhalten von CHD8-S62X-mutierten Mäusen. Vorderseite. Mol. Neurosci. 15, 1022306 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tabbaa, M., Knoll, A. & Levitt, P. Mauspopulationsgenetik, Phänokopie, Heterogenität der menschlichen Chd8-Haploinsuffizienz. Neuron 111, 539–556 e535 (2023).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hurley, S. et al. Deutliche, dosisabhängige Anforderungen an den Autismus-assoziierten Faktor CHD8 während der kortikalen Entwicklung. Mol. Autismus 12, 16 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jahn, HM et al. Verfeinerte Protokolle der Tamoxifen-Injektion zur induzierbaren DNA-Rekombination in Maus-Astroglia. Wissenschaft. Rep. 8, 5913 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Kaech, S. & Banker, G. Kultivierung von Hippocampus-Neuronen. Nat. Protokoll. 1, 2406–2415 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Moroishi, T., Nishiyama, M., Takeda, Y., Iwai, K. & Nakayama, KI Die FBXL5-IRP2-Achse ist integraler Bestandteil der Kontrolle des Eisenstoffwechsels in vivo. Cell Metab 14, 339–351 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bolger, AM, Lohse, M. & Usadel, B. Trimmomatic: ein flexibler Trimmer für Illumina-Sequenzdaten. Bioinformatik 30, 2114–2120 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, D., Langmead, B. & Salzberg, SL HISAT: ein schnell gespleißter Aligner mit geringem Speicherbedarf. Nat. Methoden 12, 357–360 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liao, Y., Smyth, GK & Shi, W. featureCounts: ein effizientes Allzweckprogramm zum Zuweisen von Sequenzablesungen zu genomischen Merkmalen. Bioinformatik 30, 923–930 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Love, MI, Huber, W. & Anders, S. Moderierte Schätzung der Faltungsänderung und Streuung für RNA-seq-Daten mit DESeq2. Genombiol. 15, 550 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Subramanian, A. et al. Gen-Set-Anreicherungsanalyse: ein wissensbasierter Ansatz zur Interpretation genomweiter Expressionsprofile. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 102, 15545–15550 (2005).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang da, W., Sherman, BT & Lempicki, RA Systematische und integrative Analyse großer Genlisten unter Verwendung von DAVID-Bioinformatikressourcen. Nat. Protokoll. 4, 44–57 (2009).

Artikel PubMed Google Scholar

Koopmans, F. et al. SynGO: eine evidenzbasierte, von Experten kuratierte Wissensdatenbank für die Synapse. Neuron 103, 217–234 e214 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Langmead, B. & Salzberg, SL Schnelle Lücken-Lese-Ausrichtung mit Bowtie 2. Nat. Methoden 9, 357–359 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, H. et al. Das Sequence Alignment/Map-Format und SAMtools. Bioinformatik 25, 2078–2079 (2009).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Y. et al. Modellbasierte Analyse von ChIP-Seq (MACS). Genombiol. 9, R137 (2008).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramirez, F. et al. DeepTools2: ein Webserver der nächsten Generation für die Deep-Sequencing-Datenanalyse. Nukleinsäuren Res. 44, W160–W165 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Levesque, M. & Avoli, M. Das Kainsäuremodell der Temporallappenepilepsie. Neurosci. Bioverhalten. Rev. 37, 2887–2899 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Racine, RJ Modifikation der Anfallsaktivität durch elektrische Stimulation. II. Motorischer Anfall. Elektroenzephalologe Klin. Neurophysiol. 32, 281–294 (1972).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Vorhees, CV & Williams, MT Morris Water Maze: Verfahren zur Beurteilung räumlicher und verwandter Formen des Lernens und Gedächtnisses. Nat. Protokoll. 1, 848–858 (2006).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Die Autoren danken M. Asamura, H. Kobayashi und C. Tambo für die allgemeine technische Unterstützung; A. Toyoda (National Institute of Genetics) für technische Unterstützung bei der RNA-seq- und ATAC-seq-Analyse; K. Ono, T. Hamaguchi und D. Muramatsu für die Verwendung der Ausrüstung für den Morris-Wasserlabyrinth-Test; T. Miyamoto für allgemeine Unterstützung und Diskussion; und Labormitglieder zur Diskussion. AK wurde durch ein Stipendium der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise durch KAKENHI-Zuschüsse von JSPS und dem japanischen Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie an MN (JP21H02847 und 16H06279 (PAGS)) und auch an AK (JP21K15726, JP21H05619 und 22H05493) unterstützt B. durch ein PRIME-Stipendium der Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) an MN (JP22gm6310008).

Abteilung für Histologie und Zellbiologie, Graduate School of Medical Sciences, Universität Kanazawa, Kanazawa, Ishikawa, 920-8640, Japan

Atsuki Kawamura und Masaaki Nishiyama

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

AK entwarf und führte Experimente durch, analysierte Daten und erstellte das Manuskript. MN trug zur Betreuung der Studie und zum Verfassen des Manuskripts bei.

Korrespondenz mit Masaaki Nishiyama.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Konstantinos Zarbalis und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Joao Valente. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Kawamura, A., Nishiyama, M. Die Deletion des Autismus-bezogenen Gens Chd8 verändert aktivitätsabhängige Transkriptionsreaktionen in postmitotischen Mausneuronen. Commun Biol 6, 593 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04968-y

Zitat herunterladen

Eingegangen: 17. Juni 2022

Angenommen: 23. Mai 2023

Veröffentlicht: 02. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04968-y

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.