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Jul 24, 2023

Eins-zu-eins-Vergleich der Zelle

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 6394 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Mit mehr als 20 von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen, mit Poly(ethylenglykol) (PEG) modifizierten Medikamenten auf dem Markt ist PEG das Goldstandard-Polymer in der Biokonjugation. Die Kopplung verbessert die Stabilität und Effizienz und kann die Blutzirkulationszeit therapeutischer Proteine ​​verlängern. Auch wenn die PEGylierung als ungiftig und nicht immunogen beschrieben wird, häufen sich Berichte mit Daten, die allergische Reaktionen auf PEG belegen. Da PEG nicht nur in der Therapie eingesetzt wird, sondern auch in Lebensmitteln und Kosmetika vorkommt, kann es auch ohne medikamentöse Behandlung zu Anti-PEG-Antikörpern kommen. Eine Überempfindlichkeit gegen PEG kann dadurch zu einer verringerten Arzneimittelwirksamkeit, einer schnelleren Blutclearance und in seltenen Fällen zu anaphylaktischen Reaktionen führen. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, Alternativen für PEG zu finden. In dieser Studie stellen wir lineares Polyglycerin (LPG) für die Biokonjugation als alternatives Polymer zu PEG vor. Wir berichten über die Konjugation von LPG und PEG durch Klick-Chemie an das Glykoprotein Erythropoetin (EPO), das in einem eukaryotischen zellfreien Proteinsynthesesystem synthetisiert wird. Darüber hinaus wurde der Einfluss der Polymere auf die Stabilität und Aktivität von EPOs auf einer wachstumshormonabhängigen Zelllinie bewertet. Die ähnlichen Eigenschaften beider Biokonjugate zeigen, dass die LPGylierung eine vielversprechende Alternative zur PEGylierung sein kann.

EPO ist als das Hormon bekannt, das die Produktion neuer roter Blutkörperchen reguliert. Die meisten neueren Veröffentlichungen befassen sich mit neuen Erkenntnissen zum Wirkmechanismus von EPO bei Erythrozytose1, ischämischem Schlaganfall2, Anämie3, Hypoxie4, Tumorangiogenese5 und neurodegenerativen Erkrankungen6. Insbesondere gentechnisch veränderte EPO-Varianten erregen Aufmerksamkeit. Erythropoetin-stimulierende Wirkstoffe (ESA) wurden kontinuierlich verbessert, angefangen bei Erythropoetin Alpha und Beta bis hin zu Varianten mit längeren Halbwertszeiten wie Darbepoetin Alfa7 und PEGyliertes EPO (PEG-EPO8). Es ist bekannt, dass PEG-EPO die Erythropoese bei einem längeren Dosierungsintervall wirksamer stimuliert9. PEGyliertes EPO (Mircera®) erhielt 2007 die Zulassung der Food and Drug Administration (FDA) und wird gegen Anämie im Zusammenhang mit Nierenerkrankungen verschrieben10,11. Aufgrund des Erfolgs von PEGyliertem EPO und anderen Biopharmazeutika wird erwartet, dass der weltweite Markt für PEGylierte Medikamente im Jahr 2024 10,5 Milliarden US-Dollar erreichen wird12. Dennoch entsteht bei den PEGylierten Biopharmazeutika ein wesentliches Problem: gegen PEG gerichtete Antikörper. PEG gilt als ungiftiges und nicht immunogenes biokompatibles Polymer, das an mehr als 20 von der FDA zugelassene proteinbasierte Arzneimittel gebunden ist13. Darüber hinaus enthalten Nicht-Protein-Therapeutika wie mRNA-Impfstoffe PEGylierte Nanopartikel14. Die PEG-modifizierten Proteine, Enzyme, Peptide und Nanopartikel zeichnen sich durch eine verbesserte Wasserlöslichkeit und proteolytische Stabilität aus, was zu einer verlängerten Halbwertszeit führt15. Obwohl erhebliche Fortschritte erzielt wurden, weisen PEGylierte Systeme immer noch bestimmte Einschränkungen auf, die ihre weitverbreitete Verwendung einschränken können. Zu diesen Einschränkungen gehört die Entwicklung von Anti-PEG-Antikörpern nach wiederholter Anwendung von PEGylierten Substanzen, die deren therapeutische Wirksamkeit verringern, und in bestimmten Fällen schwere allergische Reaktionen wie Anaphylaxie16. Eine Studie von Yang et al. identifizierten Anti-PEG-Antikörper in 72 % der zeitgenössischen Proben mithilfe eines quantitativen, kompetitiven Enzymimmunoassays17. Interessanterweise erkannten sie, dass 50 % der Serumproben aus den 1970er bis 1990er Jahren tatsächlich auch Anti-PEG-Antikörper aufwiesen. Aufgrund neuartiger und empfindlicherer Assays kommt es häufiger zum Nachweis von Anti-PEG-Antikörpern und damit verbundenen immunogenen Reaktionen. Darüber hinaus kann die Verwendung von Alltagsprodukten wie Kosmetika, Seifen und Medikamenten, die auch PEG enthalten, das Vorhandensein bereits vorhandener Anti-PEG-Antikörper beeinflussen18,19. Daher ist ein Umdenken im Umgang mit PEGylierten Arzneimitteln unerlässlich, beginnend mit einem zuverlässigen Nachweis von Anti-PEG-Antikörpern und einer präzisen Anpassung von Therapien mit PEGylierten Molekülen. Darüber hinaus wurden viele natürliche und synthetische Polymere untersucht, um PEG zur Verlängerung der Halbwertszeit zu ersetzen20,21,22,23. In diesem Zusammenhang stellt lineares Polyglycerin (LPG) aufgrund seiner ähnlichen Struktur und Eigenschaften wie PEG24 einen vielversprechenden Kandidaten dar. LPG und PEG besitzen beide ein Polyether-Rückgrat, obwohl LPG an jeder Wiederholungseinheit eine Hydroxylgruppe trägt, was die Einführung von Immobilisierungs-, Targeting- und Markierungseinheiten ermöglicht25,26. LPG ist hoch biokompatibel und Ester von Oligoglycerinen mit bis zu 10 Wiederholungseinheiten wurden von der FDA als Arzneimittel- und Lebensmittelzusatzstoffe zugelassen und sind seit einigen Jahrzehnten im Handel erhältlich27,28. LPG wurde kürzlich über verschiedene Konjugationschemien erfolgreich an verschiedene Modellproteine ​​konjugiert, darunter zufällige Konjugation an Rinderserumalbumin29, ortsspezifische Konjugation über Kupfer(I)-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) an Exenatide und N-terminale Konjugation an Interleukin30 und Anakinra31 und ortsspezifische Konjugation über spannungsgeförderte Azid-Alkin-Cycloaddition (SPAAC) an Interferon-α-2a32,33.

Obwohl die Kopplung von PEGs mit unterschiedlichen Molekulargewichten an EPO in den letzten zwei Jahrzehnten intensiv untersucht wurde, gibt es nur wenige Berichte, die die Verwendung alternativer Polymere belegen. Darüber hinaus wurde die Peptidkette häufig modifiziert, was zur Löschung von Glykosylierungsstellen führte, und die Konjugationschemie war entweder auf den N- oder C-Terminus beschränkt34. Beispielsweise wurde ein Erythropoietin-mimetisches Peptid an eine biologisch abbaubare Hydroxyethylstärke gekoppelt, wodurch die biologische Wirkung verstärkt wurde35. Oftmals basieren diese Kopplungen auf chemischen Prozessen unter rauen Bedingungen. In unserer Studie präsentieren wir erstmals einen Vergleich verschiedener Polymere, die durch eine biorthogonale Klickreaktion unter milden Bedingungen an ein EPO gekoppelt wurden, wobei alle drei N-Glykosylierungsstellen intakt waren. Darüber hinaus konnten mithilfe der zellfreien Proteinsynthese innerhalb kürzester Zeit verschiedene EPO-Konjugate synthetisiert werden, wodurch die parallele Analyse verschiedener Konstrukte ermöglicht wurde. Daher haben wir sowohl ortsspezifisches PEGyliertes als auch LPGyliertes EPO synthetisiert und deren Einfluss auf die EPO-Aktivität auf der wachstumshormonabhängigen Zelllinie TF-1 untersucht. Wir haben die TF-1-Zelllinie aufgrund des Vorhandenseins eines endogenen hEPO-Rezeptors ausgewählt. Es ist bekannt, dass sich diese Zelllinie in Gegenwart eines aktiven hämatopoetischen Wachstumsfaktors wie dem Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), verschiedenen Interleukinen und EPO vermehrt. Wir verglichen diese LPG- und PEG-Biokonjugate mit dem auf dem Markt erhältlichen Mircera® und analysierten die Stabilität der einzelnen EPOs im menschlichen Serum. Zu diesem Zweck wurde EPO wie zuvor berichtet in einem zellfreien System synthetisiert36. Die translatorisch aktiven Lysate enthalten endogene ER-abgeleitete Membranvesikel, sogenannte Mikrosomen, die eine Translokation in das Lumen und anschließende posttranslationale Modifikationen wie Glykosylierung und Disulfidbrücken37 ermöglichen – beides unabdingbare Voraussetzungen für die Aktivität von EPO. Da in zellfreien Systemen keine O-Glykosylierung möglich ist, wurde diese Position für die Kopplung der PEG- und LPG-Polymere gewählt. Daher wurde ein Amber-Stoppcodon in die Gensequenz eingeführt. Die Zugabe einer geeigneten Suppressor-tRNA und einer manipulierten Aminoacyl-tRNA-Synthetase zur zellfreien Reaktion führte zum Einbau eines p-Azido-l-phenylalanins (AzF) in die entstehende Polypeptidkette36. Die Azidogruppe wurde weiter genutzt, um über SPAAC Cyclooctin-modifiziertes PEG und LPG anzuklicken, was zu ortsspezifisch modifiziertem EPO führte. Unsere Studie zeigt, dass LPGylierte EPO-Konjugate eine vergleichbare Aktivität wie PEGylierte Gegenstücke in Zellkulturen zeigen und mehr als 24 Stunden lang stabil waren.

Wasserfreie Lösungsmittel (Dimethylformamid und Toluol) sowie Dialyseschläuche aus benzoylierter Cellulose (2 kDa, 32 mm Breite) wurden von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen. Tetra-n-octyl-Ammoniumbromid 98 % wurde von ACROS Organics gekauft und wie erhalten verwendet. Alle anderen Chemikalien wurden von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen, sofern nicht anders angegeben. 10 kDa α-Methoxy-ω-amino-poly(ethylenglykol) (PEG-NH2) (Rapp POLYMERE, Tübingen, Deutschland) wurde wie erhalten verwendet. 1H-NMR-Spektren wurden auf einem Bruker AMX 500 (Bruker Corporation) oder JEOL ECP 500 (JEOL GmbH) aufgenommen. Chemische Verschiebungen (δ) werden in ppm über den Peak des deuterierten Lösungsmittels als Standard angegeben. IR-Messungen wurden mit einem Nicolet AVATAR 320 FT_IR 5 SXC (Thermo Fisher Scientific) mit einem Detektorbereich von 4000–650/cm durchgeführt. Messungen der Gelpermeationschromatographie (GPC) in Wasser wurden mit einem Agilent 1100 durchgeführt, der mit einem automatischen Injektor, einer Isopumpe und einem Agilent 1100 Differentialrefraktometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ausgestattet war. Die PSS Suprema-Säule (Vorsäule), 1 × mit einer Porengröße von 30 Å, 2 × mit einer Porengröße von 1000 Å (alle mit einer Partikelgröße von 10 μm), wurde vor den Messungen anhand von Pullulan-Standards kalibriert. Die GPC-Messungen in Tetrahydrofuran (THF) wurden mit einem Agilent SECurity (Serie 1200) durchgeführt, das mit einem automatischen Injektor, einer Isopumpe sowie einem UV- und RI-Detektor ausgestattet war. Die Trennung erfolgte über ein Photolumineszenzgel von Agilent (1 × Vorsäule, 3 × Mixed-C mit einer Partikelgröße von 5 μm), das gegen Polystyrolstandards kalibriert wurde.

Der Acetalschutz von Glycidol, seine Polymerisation und Kettenendenmodifikation wurden auf der Grundlage zuvor von uns beschriebener Verfahren durchgeführt32. Zusammenfassend wurde in einem flammengetrockneten Schlenck-Kolben (Oct)4NBr (268 mg, 0,480 mmol, 0,008 Äquivalente) unter Argonatmosphäre getrocknet. Danach wurde es in 60 ml trockenem Toluol bei RT gelöst, bevor Ethoxyethylglycidylether (EEGE) (10 ml, 65,6 mmol, 1 Äq.) zugegeben wurde. Die Mischung wurde in einem Eisbad abgekühlt und unter Hochgeschwindigkeitsrühren schnell i-Bu3Al (2,1 ml, 2,4 mmol, 0,036 Äquivalente) zugegeben. Die Reaktion wurde über Nacht bei RT ablaufen gelassen und durch Zugabe von 1 ml Ethanol gequencht. Das Rohprodukt wurde durch Dialyse gegen Aceton (MWCO: 2000 g/mol) gereinigt. Das Produkt wurde als hellgelbes Öl erhalten (GPC in THF: Mn: 20687, Đ: 1,12). Zur Entfernung von Acetalgruppen wurde das Polymer vor der Dialyse in Wasser (MWCO: 1000 g/mol) mindestens zwei Stunden lang in Ethanol (0,1 g/ml) und HCl (3 % v/v Ethanol) gelöst. Das Produkt wurde als farbloses Öl erhalten (GPC-Wasser: Mn: 11885, Đ: 1,19). Danach wurde das entschützte Polymer (1 g, 0,08 mmol, 1 Äquivalent) in 5 ml trockenem DMF gelöst und unter Rückfluss auf 80 °C erhitzt, bevor NaN3 (30 mg, 0,4 mmol, 5 Äquivalent) zu der Mischung gegeben wurde. Die Reaktion lief bei dieser Temperatur drei Tage lang ab und wurde durch Dialyse in Wasser (MWCO: 1000 g/mol) gereinigt. Die erfolgreiche Modifikation wurde durch IR-Spektroskopie beobachtet (2100/cm des Azidpeaks). Die Azidgruppe wurde durch Auflösen von LPG-N3 (1 Äquivalent) in Wasser (0,05 g/ml) zum Amin reduziert. Anschließend wurde der Lösung TCEP (1,5 Äquivalente für N3-Gruppen) zugesetzt. Die Reaktion wurde durch IR-Spektroskopie verfolgt, bis die entsprechende N3-Bande verschwand. Danach erfolgte die Reinigung durch Dialyse in Wasser (MWCO: 1000 g/mol). LPG-NH2 (1 Äquivalent) wurde dann in trockenem DMF (32 mg/ml) gelöst, dann wurden Et3N (3 Äquivalente) und BCN-NHS (1,5 Äquivalente) zu der Mischung gegeben. Die Reaktion wurde über Nacht gerührt und durch Dialyse gegen Wasser (MWCO: 1000 g/mol) gereinigt. Da LPG-modifiziertes BCN im trockenen Zustand zur Vernetzung neigt, wird in diesem Stadium von einer vollständigen Umwandlung ausgegangen. Die Qualität von LPG-BCN wurde mittels 1HNMR-Spektrum überwacht (ergänzende Abbildung 1). Basierend auf der GPC-Messung in Wasser hat das LPG ein MW von 11,8 kDa.

Die Modifizierung von kommerziellem PEG-NH2 erfolgte wie oben für LPG-NH2 beschrieben. Die Qualität von PEG-BCN wurde mittels 1HNMR-Spektrum überwacht (ergänzende Abbildung 2). Basierend auf der GPC-Messung in Wasser hat das PEG ein MW von 10 kDa.

Die Gensequenz, die die Erythropoietin-Sequenz (Uniprot P01588) kodiert, wurde für die zellfreie Proteinsynthese und Amber-Unterdrückung modifiziert. Daher wurde die DNA-Matrize wie zuvor berichtet geändert38. Darüber hinaus wurde die native Signalsequenz durch eine Melittin-Signalsequenz (aaattcttagtcaacgttgcccttgtttttatggtcgtatacatttcttacatctatgcggac) ersetzt. Ein zweites Konstrukt wurde entworfen, indem das Codon 153 (O-Glykosylierungsstelle) gegen ein Amber-Stoppcodon ausgetauscht wurde. Die Sequenzen wurden durch De-novo-Synthese (Biocat GmbH, Deutschland) hergestellt und in das Vektorrückgrat pUC57-1.8 k ligiert.

Die manipulierte Aminoacyl-tRNA-Synthetase (eAzFRS) und die Suppressor-tRNA wurden wie ausführlich in Zemella et al. beschrieben hergestellt. 201939. Kurz gesagt, die Aminoacyl-tRNA-Synthetase wurde im „RTS500 ProteoMaster E. coli HY Kit“ (Biotechrabbit GmbH, Deutschland) synthetisiert, über Strep-Tag gereinigt, konzentriert und bei – 80 °C in einem Synthetase-Lagerpuffer (50 °C) gelagert mM HEPES, 10 mM KOAc, 1 mM MgCl2, 4 mM DTT, 0,02 % NaN3, pH 7,6).

Die Matrizen-DNA für die Suppressor-tRNA wurde mithilfe einer PCR-Reaktion mit einem spezifischen O-Methyl-Primerpaar und anschließender Run-off-Transkription erzeugt. tRNA wurde durch Phenol-Chloroform-Extraktion unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (ThermoFisher Scientific) gereinigt, mit Isopropanol ausgefällt und in hochreinem Wasser resuspendiert. tRNA wurde in einem PCR-Cycler (Biometra TRIO, Analytik Jena) gefaltet und bei –80 °C gelagert.

Die zellfreie Proteinsynthese basierte auf translatorisch aktiven Lysaten, die aus kultivierten Spodoptera frugiperda 21 (Sf21)-Zellen stammten. Die Lysatvorbereitung erfolgte wie zuvor beschrieben40,41. DNA-Matrize (60 ng/µL) wurde zu einer Reaktionsmischung gegeben, die aus 20 % (v/v) Lysat, 100 µM Aminosäuren, Salzen, Energiekomponenten und PolyG (10 µM, Biomere, Deutschland) bestand. Ein detailliertes Protokoll der Reaktion ist in38,42 beschrieben. Um die Proteinausbeute mittels Szintillationszählung und die Proteinintegrität mittels SDS-PAGE und anschließender Autoradiographie zu überwachen, wurde der Reaktion einheitlich radioaktiv markiertes 14C-Leucin (fc 30 µM, Perkin Elmer, Deutschland) zugesetzt. Das 14C-Leucin wird statistisch in das de novo synthetisierte Protein eingebaut. Für den Einbau der nicht-kanonischen Aminosäure wurden 2 mM p-Azido-l-phenylalanin, 3 µM eAzFRS und 5 µM Suppressor-tRNA hinzugefügt. Die erfolgreiche Integration wurde durch Autoradiographie überwacht. Im Detail wurde eine gekoppelte Transkriptions-Translations-Reaktion unter Verwendung des Plasmids, das ein Amber-Stoppcodon enthielt, in Gegenwart und Abwesenheit der orthogonalen Synthetase eAzFRS durchgeführt. Die Synthesereaktion in Abwesenheit von eAzFRS führt zu einem Bandenmuster, das dem an Aminosäure 153 verkürzten EPO entspricht. Dieses verkürzte EPO besitzt immer noch alle drei N-Glykosylierungen. Die Synthesereaktion in Gegenwart von eAzFRS führt zu einem Bandenmuster, das dem EPO voller Länge mit drei N-Glykosylierungen entspricht. Ein Unterschied im Bandenmuster – insbesondere eine Verschiebung des scheinbaren Molekulargewichts von EPO in Gegenwart der Synthetase – bestätigt den Einbau von AzF. Darüber hinaus wurde der Einbau von AzF zuvor durch die spezifische Kopplung eines Azid-reaktiven Phosphinfarbstoffs an EPO36 gezeigt.

Die Reaktionen wurden 3 Stunden lang bei 27 °C und 500 U/min inkubiert und mit einer Aluminiumfolie abgedeckt.

Da EPO in das Lumen mikrosomaler Vesikel verlagert wird, musste das Protein freigesetzt werden. Daher wurden die Mikrosomen 10 Minuten lang bei 4 °C und 16.000 × g zentrifugiert und das Pellet in PBS mit dem Detergens n-Dodecyl-β-Maltosid (0,2 % DDM, Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA) resuspendiert. , 45 min bei 1000 U/min gerührt und erneut zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein leeres Eppendorf-Röhrchen überführt und zur Kopplung von PEG- und LPG-Polymeren sowie für Stabilitätsanalysen und Zellkulturtests verwendet.

Die Polymere wurden in Wasser bis zu einer Stammkonzentration von 5–10 mM gelöst. 10 ng zellfrei produziertes EPO wurden mit 5 mM BCN-PEG und BCN-LPG in einem Eppendorf-Röhrchen über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Kopplung der Polymere wurde durch eine Verschiebung von EPO in der Autoradiographie überwacht.

N-Glykosylierungen von modifiziertem und unmodifiziertem EPO wurden durch PNGase F (NEB, USA) gespalten. Der Test wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.

Die Proteinausbeute an zellfrei synthetisiertem EPO wurde durch Fällung mit heißer Trichloressigsäure (TCA, Carl Roth GmbH, Deutschland) und anschließende Flüssigszintillationszählung bestimmt43.

EPO-Proben wurden in kaltem Aceton ausgefällt, getrocknet und in LDS-Probenpuffer (NuPAGE LDS-Probenpuffer, Thermo Fisher Scientific) wieder aufgelöst. Die Proben wurden auf vorgefertigte SDS-PAGE-Gele (NuPAGE, 10 % Bis-Tris, Thermo Fisher Scientific) geladen und 40 Minuten lang bei 180 V getrennt. Die Gele wurden mit Wasser gewaschen, mit einfachem blauen Sicherheitsfarbstoff (Thermo Fisher Scientific) gefärbt und gewaschen wieder. Anschließend wurden die Gele 60 Minuten lang bei 70 °C getrocknet (Unigeldryer 3545D, Deutschland). Die Gele wurden 48 Stunden lang Phosphorschirmen ausgesetzt. Die Banden wurden durch Phosphor-Bildgebung (Amersham Typhoon RGB, GE Healthcare) sichtbar gemacht.

TF-1-Zellen (Leibnitz-Institut DSMZ, Deutschland, DSMZ-Nr. ACC-334), die den hEPO-Rezeptor exprimieren, wurden in 85 % RPMI-1640 (PAN Biotech), 13 % FCS (Biochrom), 1 % Natriumpyruvat (Biowest) kultiviert ), 1 % Penicillin-Streptomycin (PAN Biotech) und 5 ng/ml GM-CSF (PeproTech, Deutschland). Die Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 in T25- und T75-Kolben in einem CO2-Inkubator (Binder, Deutschland) inkubiert. Die Zelldichte wurde zwischen 2 und 7 × 105 Zellen/ml gehalten. Für den Aktivitätstest wurden 2,0 × 105 Zellen in frisches Medium ohne GM-CSF überführt. Jede EPO-Variante (zellfrei synthetisiertes, rekombinantes EPO (Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA, #E5546-50 UG), Mircera® (Roche, Basel, Schweiz, 0,3 ml)) und GM-CSF wurden mit hinzugefügt eine Endkonzentration von 10 ng/ml. Als Negativkontrolle wurde ein gleiches Volumen einer No-Template-Kontrolle (NTC) hinzugefügt. Das Zellwachstum wurde über eine Woche durch Trypanblau-Färbung in einer Luna-Zählkammer (Logos Biosystems) überwacht. Der Assay wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt und für jede Probe wurden zwei Messungen durchgeführt, was zu sechs gezählten Aliquots für jede Probe führte.

EPO wurde wie oben beschrieben synthetisiert und an PEG und LPG gekoppelt. Modifiziertes und nicht modifiziertes EPO wurde mit Humanserum (SeraCon II, HiSS Diagnostics, Deutschland) bis zu 24 Stunden lang inkubiert. Nach 0, 2, 4, 8 und 24 Stunden wurde ein Aliquot entnommen und sofort mit flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Aliquots wurden in Aceton ausgefällt und auf eine SDS-PAGE geladen. Die Integrität der Proteinbanden wurde durch Autoradiographie analysiert.

Ein allgemeines Schema der Synthese und Kettenendmodifikation von LPG und PEG mit der folgenden Kopplung an zellfrei synthetisiertes EPO ist in Abb. 1 dargestellt.

Allgemeines Schema der Synthese und Kettenendmodifikation von LPG und PEG mit anschließender Kopplung an zellfrei synthetisiertes EPO. EPO-Struktur aus PDB-Eintrag 1BUY44.

Die zellfreie Proteinsynthese von EPO führte zu einem deutlichen Bandenmuster mit vier definierten Banden (Abb. 2A). Diese Banden entsprechen den drei N-Glykosylierungen von EPO (glykosyliert an einer, zwei oder drei Stellen) und der nicht glykosylierten Form von EPO. Die zusätzliche O-Glykosylierung von EPO wird bei der zellfreien Proteinsynthese nicht berücksichtigt. Daher wurde die nichtkanonische Aminosäure an der Position der O-Glykosylierung platziert. Die Einführung der nichtkanonischen Aminosäure p-Azido-l-phenylalanin (AzF) an der Position der O-Glykosylierung veränderte das Glykosylierungsmuster von EPO nicht (Azido-EPO, Spur 3). Der Glykoverdau mit PNGase F führte für beide Proben zu einer niedrigeren Bande beim erwarteten Molekulargewicht von nicht glykosyliertem EPO (Spur 2 und 4). Ohne die Anwendung orthogonaler Synthetase während der zellfreien Synthese wurde in der Autoradiographie kein EPO in voller Länge sichtbar gemacht (Spur 5). Zusätzlich wurde das glykosylierte Terminationsprodukt nachgewiesen. Nach der Inkubation mit PNGase F wurde nur das deglykosylierte Terminationsprodukt nachgewiesen (Spur 6).

Chemoselektive Kopplung von Erythropoetin mit LPG-BCN und PEG-BCN. (A) Autoradiographie verschiedener EPO-Varianten: Spur 1 und 2 Volllängen-EPO ohne nicht-kanonische Aminosäure, Spur 3 und 4 Unterdrückungsprodukt mit eingebautem p-Azido-L-Phenylalanin, Spur 5 und 6 Terminationsprodukt mit bernsteinfarbenem Abschluss Stopp-Codon. Jede Variante wurde in Abwesenheit (Spur 1, 3, 5) und Anwesenheit (Spur 2, 4, 6) von Glycosidase-PNGase F analysiert. Der erfolgreiche Einbau von AzF führte zu einem vergleichbaren Bandenmuster wie beim EPO voller Länge ohne Nicht- kanonische Aminosäure. Die Synthese von EPO (mit Amber-Stoppcodon) in Abwesenheit von eAzFRS führte zu einem Bandenmuster mit reduziertem Molekulargewicht, wie es für das verkürzte Produkt erwartet wurde. (B) Autoradiographie nach Kopplung von LPG-BCN und PEG-BCN an EPO. Spur 1–4 und Spur 9 zeigen die Kopplung von LPG-BCN an AzF, das EPO (Spur 1–2), terminiertes EPO (Spur 3–4) und EPO voller Länge (Spur 9) in Abwesenheit (Spur 1 und 3) enthält. und Vorhandensein (Spur 2, 4, 9) von PNGase F. Die erfolgreiche Kopplung von LPG-BCN an AzF, das EPO enthält, zeigt sich an einer Verschiebung der EPO-entsprechenden Banden zu einem höheren Molekulargewicht (Spur 1 und 2) bei etwa 50–60 kDa. Spur 5–8 und Spur 10 zeigen die Kopplung von PEG-BCN an AzF, das EPO (Spur 5–6), terminiertes EPO (Spur 7–8) und EPO voller Länge (Spur 10) in Abwesenheit enthält (Spur 5 und 7). und Anwesenheit (Spur 6, 8, 10) von PNGase F. Die erfolgreiche Kopplung von PEG-BCN an AzF, das EPO enthält, zeigt sich an einer Verschiebung der EPO-entsprechenden Banden zu einem höheren Molekulargewicht (Spur 5 und 6) bei etwa 40–48 kDa. Unbeschnittene Autoradiographiebilder sind in den Zusatzinformationen enthalten.

Da in einem ersten Schritt der Einbau von AzF verifiziert wurde, wurde Azido-EPO mit BCN-modifiziertem PEG und LPG inkubiert, um das ortsspezifische Biokonjugat zu erhalten (Abb. 2B). Die Inkubation von Azido-EPO mit LPG-BCN führte zu einem schwächeren Bandenmuster beim erwarteten Molekulargewicht für ungekoppeltes EPO. Zusätzliche, höhermolekulare Abstriche und Banden sind sichtbar, was auf eine erfolgreiche Kopplung des Polymers hinweist (Abb. 2B, Spur 1). Diese Annahme wird durch die Inkubation des LPG-BCN mit dem verkürzten EPO bestätigt, das aus der Termination am Amber-Stopcodon resultiert. Hier waren über dem Terminationsprodukt für LPG-BCN (Spur 3) keine zusätzlichen Banden sichtbar. Die Glykoverdauung des LPG-EPO führte zu einer Verschiebung des Ausstrichs zu einem niedrigeren Molekulargewicht, was darauf hindeutet, dass glykosyliertes EPO erfolgreich an LPG-BCN gekoppelt wurde (Spur 2).

Ein ähnliches Ergebnis wurde für die Inkubation von Azido-EPO mit PEG-BCN erhalten. Hier sind definierte Banden mit höherem Molekulargewicht sichtbar, was die Kopplung von PEG-BCN an Azido-EPO bestätigt (Spur 5). Auch hier verschob sich die markante Bande nach dem PNGase-F-Verdau zu einem niedrigeren scheinbaren Molekulargewicht, was darauf hinweist, dass glykosyliertes Azido-EPO erfolgreich an PEG-BCN gekoppelt wurde (Spur 6). Im Gegensatz zu LPG-BCN wird durch Autoradiographie eine leicht unspezifische Kopplung an das Terminationsprodukt von PEG-BCN nachgewiesen (Spur 7). Dies wird noch deutlicher durch die Inkubation von deglykosyliertem EPO (ohne Azidogruppe) mit den Polymeren (Spur 4 und 8). Hier wird keine Kopplung erwartet, da im übersetzten EPO kein AzF vorhanden ist. Daher sollte im Autoradiogramm ein vergleichbares Bandenmuster wie in Abb. 1 Spur 5 sichtbar sein. Tatsächlich ist das gleiche Bandenmuster in Gegenwart von LPG sichtbar. Im Gegensatz dazu ist eine leichte zusätzliche Bande in Gegenwart von PEG ein sichtbarer Hinweis auf eine leichte unspezifische Bindung von PEG an verkürztes EPO. Eine vergleichbare unspezifische Kopplung von PEG-BCN an EPO voller Länge ohne eingebautes AzF wurde ebenfalls nachgewiesen (Spur 10). Es wurde keine unspezifische Kopplung von LPG-BCN an EPO voller Länge ohne eingebautes AzF beobachtet (Spur 9). Zusätzliche Kontrollen zeigten die erwarteten Ergebnisse (ergänzende Abbildung 3) und bestätigten die Integration von AzF und die anschließende Kopplung jedes Polymers. Dennoch wurde für die Zellkulturanalyse eine Mischung aus LPG-gekoppeltem EPO und nicht-gekoppeltem EPO erhalten. Basierend auf der Autoradiographie enthalten etwa 50–70 % der Probe LPG-gekoppeltes EPO, während die restlichen 30–50 % aus ungekoppeltem EPO bestehen. Da die Kopplung von PEG an EPO zu einer Effizienz von nahezu 100 % führte, schätzen wir, dass der Prozentsatz an PEG-gekoppeltem EPO für Zellkulturassays bei etwa 90 % liegt. Die restlichen 10 % setzen sich aus ungekoppeltem EPO und unspezifisch gekoppeltem PEG-EPO zusammen.

Zur Bestimmung der Aktivität der einzelnen EPO-Varianten wurde eine wachstumshormonabhängige Zelllinie (TF-1-Zellen) in An- und Abwesenheit von modifiziertem und nicht-modifiziertem EPO kultiviert (Abb. 3 und 4). Der Aktivitätstest zeigte, dass jede Probe, die EPO enthielt, zu einem Zellwachstum führte, das mit kommerziell erhältlichem EPO vergleichbar war. Der stärkste Effekt wurde nach Zugabe von PEG-EPO beobachtet (Abb. 3). Im Vergleich zu unmodifiziertem EPO und kommerziell erhältlichem PEGyliertem EPO (Mircera®) war der Effekt sogar noch höher. Wie erwartet zeigten die Kontrollen (keine Template-Kontrolle und Terminationsprodukt) keine oder nur eine begrenzte Aktivität (Terminationsprodukt). Interessanterweise zeigten das PEG-modifizierte EPO und das nicht-modifizierte EPO bis zum 4. Tag nahezu vergleichbare Wachstumskurven. Die Wachstumskurve des unmodifizierten EPO erreichte ihr Maximum nach 4 Tagen, während der Höhepunkt des PEG-modifizierten EPO nach 5 Tagen berechnet wurde. Darüber hinaus zeigten mit PEG-modifiziertem EPO inkubierte Zellen eine verlängerte Wachstumskurve.

Zellbasierter Aktivitätstest von PEG-modifiziertem und nicht modifiziertem zellfrei synthetisiertem EPO. Wachstumskurven der TF-1-Zelllinie, ergänzt mit PEG-modifiziertem EPO (durchgezogene Linie), nicht-modifiziertem EPO (gestrichelte Linie), Terminationsprodukt (gestrichelte Linie mit einem Punkt), zellfreier No-Template-Kontrolle (NTC, gestrichelte Linie). Doppelpunktlinie), kommerzielles EPO (gestrichelte Linie) und kommerzielles Mircera® (graue gestrichelte Linie). Die Konzentrationen zellfrei synthetisierter EPO-Varianten wurden durch TCA-Fällung bestimmt. 10 ng/ml jeder Probe wurden zu den TF-1-Zellen gegeben, die in einer Platte mit 24 Vertiefungen kultiviert wurden. Die Zellen wurden 6 Tage lang gezählt. Die Daten werden als Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten dargestellt, die in Duplikaten gemessen wurden (n = 3).

Zellbasierter Aktivitätstest von LPG-modifiziertem und nicht modifiziertem zellfrei synthetisiertem EPO. Wachstumskurven der TF-1-Zelllinie, ergänzt mit LPG-modifiziertem EPO (durchgezogene Linie), nicht modifiziertem EPO (gestrichelte Linie), Terminationsprodukt (gestrichelte Linie mit einem Punkt), zellfreier No-Template-Kontrolle (NTC, gestrichelte Linie). Doppelpunktlinie), kommerzielles EPO (gestrichelte Linie) und kommerzielles Mircera® (graue gestrichelte Linie). Die Konzentrationen zellfrei synthetisierter EPO-Varianten wurden durch TCA-Fällung bestimmt. 10 ng/ml jeder Probe wurden zu den TF-1-Zellen gegeben, die in einer Platte mit 24 Vertiefungen kultiviert wurden. Die Zellen wurden 6 Tage lang gezählt. Die Daten werden als Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten dargestellt, die in Duplikaten gemessen wurden (n = 3).

Ein vergleichbarer Effekt zeigte sich nach Zugabe von LPG-EPO und den entsprechenden Kontrollen (Abb. 4). Die höchste Wachstumsrate wurde nach Zugabe von kommerziellem EPO ermittelt, was zu einer maximalen Zelldichte von 7 × 105 Zellen/ml führte. Auch hier war die Wirkung von LPG-EPO mit einer maximalen Zelldichte von 6,2 × 105 Zellen/ml vergleichbar mit kommerziellem EPO. Bemerkenswerterweise stimmte das Maximum der gezählten Zellen nach Zugabe von LPG-EPO mit PEG-EPO am Tag 4 und 5 überein. Die Wirkung von LPG-EPO war im Vergleich zur Zugabe von PEG-EPO sogar noch höher. Auch hier führte die Zugabe von zellfreiem, synthetisiertem, nicht modifiziertem EPO zu einer maximalen Zelldichte am Tag 4 mit 5,5 × 105 Zellen/ml.

Bei den Kontrollen wurden die erwarteten Ergebnisse festgestellt: Zellen sterben in Gegenwart von Terminationsprodukt und NTC schnell ab. Zusätzliche Kontrollen zeigten keine Wirkung der Polymere auf die Zellkultur (ergänzende Abbildung 4).

Die Wirkung von konjugiertem LPG und PEG auf die Stabilität von EPO wurde durch einen Serumstabilitätstest weiter analysiert (Abb. 5). Modifizierte und nicht modifizierte EPO-Varianten wurden 24 Stunden lang in menschlichem Serum inkubiert. Die Proben wurden zu vorher festgelegten Zeitpunkten gesammelt. Die Proteinintegrität wurde durch Autoradiographie analysiert. Nicht modifiziertes EPO (in voller Länge und mit nicht-kanonischer Aminosäure) zeigte das charakteristische Bandenmuster bestehend aus nicht glykosyliertem EPO und zusätzlichem EPO, das an bis zu drei Stellen glykosyliert ist. PEG-EPO zeigte nur eine Bande mit einem höheren Molekulargewicht als EPO, was dem polymergekoppelten Protein entspricht. Es wurde kein entkoppeltes Protein nachgewiesen. LPG-EPO zeigte erneut einen Schlieren oberhalb der PEG-EPO-Bande. Leichte Banden für ungekoppeltes EPO sind sichtbar. Die Konjugation von PEG und LPG zeigte keinen signifikanten Einfluss auf die Serumstabilität von EPO, da alle Biokonjugate auch nach 24-stündiger Inkubation in menschlichem Serum ein vergleichbares Bandenmuster zeigten.

Stabilitätsanalyse von modifiziertem und nicht modifiziertem EPO. Unmodifiziertes EPO voller Länge, unmodifiziertes EPO mit einer nicht-kanonischen Aminosäure (ncaa), PEG-modifiziertes und LPG-modifiziertes EPO wurden bis zu 24 Stunden in menschlichem Serum inkubiert. Anschließend wurden die Proben mit Aceton ausgefällt und mittels SDS-PAGE mit anschließender Autoradiographie analysiert. Nach 24 Stunden war keine Veränderung im Bandenmuster zu erkennen, was auf stabile EPO-Proben hinweist. Unbeschnittene Autoradiographiebilder sind in den Zusatzinformationen enthalten.

Poly(ethylenglykol) (PEG) gilt als „Goldstandard“ zur Verbesserung von Proteineigenschaften wie Stabilität, Löslichkeit und Immunogenität. In den letzten 30 Jahren wurde eine breite Palette verschiedener PEG-Strukturen hergestellt, die von kleinen Molekulargewichten (550 Da) bis zu großen linearen und verzweigten Polymeren (> 8.000.000 Da)45 reichen. Während im Jahr 1992 nur sieben verschiedene PEG-Strukturen in kosmetischen Produkten nachgewiesen wurden46, stieg diese Zahl im Jahr 2015 auf über 340 verschiedene PEG-Strukturen47. Die häufige Verwendung von PEG hängt auch mit dem inerten und nicht immunogenen Verhalten von PEG zusammen. Aktuelle Berichte zeigen jedoch, dass Anti-PEG-Antikörper nach Injektion von PEGylierten Liposomen, Proteinen48,49 und nach Kontakt mit PEG-haltigen Kosmetikprodukten auftreten können. Insbesondere mehrere kurze PEG-Ketten (< 10 kDa), die an Proteine ​​gebunden sind, haben eine höhere Wahrscheinlichkeit, Anti-PEG-Antikörper zu induzieren50,51. Eine aktuelle Studie hat den Einfluss bereits vorhandener Anti-PEG-IgM- und IgG-Antikörper auf die therapeutische Wirksamkeit von PEGyliertem EPO52 analysiert. Zu diesem Zweck wurde vor der PEG-EPO-Verabreichung ein Mausmodell mit vorinjizierten monoklonalen Anti-PEG-Antikörpern etabliert. Infolgedessen wurde die Fähigkeit von PEG-EPO, die Produktion neuer roter Blutkörperchen zu induzieren, durch Anti-PEG-Antikörper blockiert, da sich PEG-EPO in Leber und Milz ansammelte. Die biologische Aktivität von PEG-EPO wurde durch Erhöhung der Anfangskonzentration wiederhergestellt. Daher sollte die geeignete PEG-EPO-Dosis anhand einer Messung bereits vorhandener Anti-PEG-Antikörper bei einzelnen Patienten beurteilt werden. Alternativ könnten neuartige Biomoleküle, die eine ähnliche Funktion wie PEG haben, aktuelle Probleme mit Anti-PEG-Antikörpern umgehen.

Mittlerweile werden alternative synthetische Polymere wie Poly(glycerine), Poly(oxazoline), Poly(hydroxypropylmethacrylat), Poly(2-hydroxyethylmethacrylat), Poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamid), Poly(vinylpyrrolidon), Poly(N ,N-Dimethylacrylamid) und Poly(N-acryloylmorpholin) wurden als Ersatz für PEG53,54 untersucht. Jedes der Polymere weist einzigartige Vorteile wie Nicht-Immunogenität, hohe Hydrophilie, gute Biokompatibilität, aber auch Nachteile wie Akkumulation, Nicht-Bioabbaubarkeit und teilweise hohe Synthesekosten auf55. Daher müssen Polymere im Detail evaluiert werden, um Informationen über die Eigenschaften der einzelnen Proteine ​​und ihre möglichen Auswirkungen auf den menschlichen Körper zu gewinnen.

Aufgrund der strukturellen Eigenschaften von linearem Polyglycerin (LPG) stellt es einen vielversprechenden Kandidaten für die Konjugation an Proteine ​​dar. In einer Studie zum Vergleich der PEG- und LPGylierten Liposomen haben Abu Lila et al. beobachteten, dass die Modifikation mit LPG im Gegensatz zu PEGylierten Liposomen die In-vivo-Leistung des Systems steigert. LPGylierte Liposome induzierten keine beschleunigte Blutclearance (ABC), eine Einschränkung von PEGylierten Liposomen bei wiederholter Verabreichung, die die pharmazeutische Aktivität negativ beeinflussen kann56.

Imran Ul-haq et al. verglichen PEG und LPG in In-vitro- und In-vivo-Umgebungen. Sie zeigten, dass LPG beim Vergleich von Molekülen gleicher Größe eine 25-mal geringere Grenzviskosität als PEG aufweist. Diese Eigenschaft ist in Formulierungen, in denen höhere Konzentrationen erforderlich sind, von großer Bedeutung. Darüber hinaus wurde in Studien, die auf Assays zur Aggregation roter Blutkörperchen (RBC) und Hämolyse basierten, beobachtet, dass LPG selbst bei Konzentrationen von 10 mg/ml keine RBC-Aggregation induzierte, während PEG bei dieser Konzentration eine massive RBC-Aggregation induzierte57. Dies wurde bereits zuvor auch für PEG und LPG58 mit geringerem Molekulargewicht beobachtet.

Die zellfreie Proteinsynthese wurde ausgewählt, um grundlegende Eigenschaften von PEG- und LPG-basierten Polymeren zu analysieren, wie z. B. den Einfluss auf die Proteinstabilität und -integrität sowie den Einfluss auf kultivierte menschliche Zellen. Die erfolgreiche Synthese und Modifikation von EPO in zellfreien Proteinsynthesesystemen wurde bereits zuvor gezeigt36. Im Gegensatz zur Studie von 2018 haben wir nun den Einfluss gekoppelter Polymere auf die Eigenschaften von EPOs analysiert. Interessanterweise zeigten beide Polymere nach dem Kopplungsprozess ein unterschiedliches Verhalten. Nach der Konjugation der Polymere war auf der SDS-PAGE eine deutliche Verschiebung zu höheren Molekulargewichten sichtbar. Tatsächlich sah die Gelmigration bei beiden Polymeren unterschiedlich aus, obwohl LPG-BCN und PEG-BCN ein ähnliches Molekulargewicht von 10 kDa haben. Dieser Effekt kann durch spezifische Wechselwirkungen der Polymere innerhalb der SDS-PAGE erklärt werden, wie zuvor für PEG59 beschrieben. Darüber hinaus wurde ein vergleichbarer Effekt auch nach der Kopplung von LPG-BCN und PEG-BCN an menschliches Interleukin-431 beobachtet. Zusätzlich zur veränderten Gelmigration zeigte die Biokonjugation von LPG und PEG unterschiedliche Kopplungseffizienzen. Für PEG-BCN wird ein Kopplungswirkungsgrad von 90–95 % und für LPG-BCN ein Kopplungswirkungsgrad von 50 % geschätzt. Diese Unterschiede können aufgrund spezifischer Protein-Polymer-Wechselwirkungsprofile auftreten. Im Fall von PEG-BCN werden positiv geladene Lysine und Arginine beschrieben, wohingegen LPG in unmittelbarer Nähe zu Serinen und Methioninen gefunden wurde32. Der Anteil an Lysinen und Argininen ist bei EPO im Vergleich zu Methioninen und Serinen deutlich höher. Unabhängig davon war die Kopplungseffizienz für beide Polymere ausreichend, was zu einem spezifischen Signal führte, das durch Autoradiographie bestimmt wurde. Folglich wurde die Wirkung von nicht modifiziertem und modifiziertem EPO auf die Zellkultur bestimmt. Wachstumskurven zeigten die erwarteten Ergebnisse, da Zellen nur in Gegenwart von EPO-Varianten wuchsen. Dennoch waren Unterschiede zwischen den EPO-Varianten sichtbar. Innerhalb der ersten drei Tage war das Wachstum der Zellen bei Stimulation durch nicht-modifiziertes und PEG- und LPG-EPO nahezu identisch. Nach Tag 4 hörte das Wachstum der mit nicht-modifiziertem EPO inkubierten Zellen auf, während die mit beiden modifizierten EPOs inkubierten Zellen weiter wuchsen. Dies weist auf eine verlängerte Aktivität von polymermodifiziertem EPO hin. Diese Ergebnisse stimmen mit den beschriebenen positiven Effekten der polymerkonjugierten EPO-Varianten überein7,8.

Die erhaltenen Daten aus dem Stabilitätstest stimmen auch mit früheren Erkenntnissen überein. In einer früheren Studie wurden EPO-haltige Serum- und Plasmaproben gesammelt und diese Proben 14 Tage lang unter verschiedenen Bedingungen gelagert. Selbst die bei Raumtemperatur gelagerte Probe enthielt nach 14 Tagen immunreaktives EPO60.

Da die zellfreie Proteinsynthese im µL- bis Liter-Maßstab durchgeführt werden kann und die Synthese pharmazeutisch relevanter Proteine ​​wie EPO typischerweise innerhalb weniger Stunden durchgeführt wird, bietet das System eine hervorragende Wahl für das Screening von PEG-Alternativen, gekoppelt an vorab definierte Positionen im menschlichen EPO.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Informationsdateien) enthalten.

Poly (ethylenglykol)

Lineares Polyglycerin

Erythropoietin

Kupferkatalysierte Alkin-Azid-Cycloaddition

Spannungsvermittelte Azid-Alkin-Cycloaddition

Bicyclo[6.1.0]non-4-in

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P-Azido-l-phenylalanin

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Für die Sf21-Lysat-Herstellung danken die Autoren D. Wenzel und Dipl.-Ing. Ing. (FH) DA Wüstenhagen (Fraunhofer IZI-BB, Potsdam-Golm, Deutschland).

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL. Diese Forschung wurde vom Ministerium für Wissenschaft, Forschung und Kultur (MWFK, Brandenburg, Deutschland), Projekt PZ-Syn (Projektnummer F241-03-FhG/005/001) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF, Deutschland) gefördert. Deutschland), Projekt CEFOX (031B0831) und Projekt Next-PEG (13XP5049A).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Paria Pouyan, Anne Zemella, Rainer Haag und Stefan Kubick.

Institut for Chemistry and Biochemistry, Freie Universität Berlin, Takustr. 3, 14195, Berlin, Germany

Paria Pouyan & Rainer Haag

Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie (IZI), Institutsteil Bioanalytik und Bioprozesse (IZI-BB), Am Mühlenberg 13, 14476, Potsdam, Deutschland

Anne Zemella, Jeffrey L. Schloßhauer, Ruben M. Walter & Stefan Kubick

Institute of Chemistry and Biochemistry-Biochemistry, Freie Universität Berlin, Takustr. 6, 14195, Berlin, Germany

Jeffrey L. Schloßhauer & Stefan Kubick

Institute of Biotechnology, Technische Universität Berlin, Gustav-Meyer-Allee 25, 13355, Berlin, Germany

Ruben M. Walter

Fakultät für Gesundheitswissenschaften, gemeinsame Fakultät der Brandenburgischen Technischen Universität Cottbus-Senftenberg, der Brandenburgischen Medizinischen Hochschule Theodor Fontane und der Universität Potsdam, Potsdam, Deutschland

Stefan Kubick

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PP: Konzeptualisierung, Datenkuration, formale Analyse, Untersuchung, Methodik, Validierung, Visualisierung, Schreiben; AZ: Konzeptualisierung, Datenkuration, formale Analyse, Untersuchung, Methodik, Validierung, Visualisierung, Schreiben; JLS: Datenkuratierung, -überprüfung; RMW: Datenkuration, Überprüfung, SK: Konzeptualisierung, Finanzierungseinwerbung, Projektverwaltung, Ressourcen, Überwachung, Validierung, Überprüfung, Bearbeitung, RH: Konzeptualisierung, Finanzierungseinwerbung, Projektverwaltung, Ressourcen, Überwachung, Validierung, Überprüfung, Bearbeitung

Korrespondenz mit Anne Zemella oder Rainer Haag.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Pouyan, P., Zemella, A., Schloßhauer, JL et al. Eins-zu-eins-Vergleich von zellfrei synthetisierten Erythropoietin-Konjugaten, modifiziert mit linearem Polyglycerin und Polyethylenglykol. Sci Rep 13, 6394 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33463-x

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Eingegangen: 25. Januar 2023

Angenommen: 13. April 2023

Veröffentlicht: 19. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33463-x

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