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May 18, 2023

Synthese vs. Estergewinnung

Band Kommunikationsbiologie

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 306 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Toxoplasma gondii ist ein weit verbreiteter zoonotischer Erreger, der sowohl Nutztiere als auch Menschen befällt. Die außergewöhnliche Fähigkeit dieses Parasiten, sich in verschiedenen Arten kernhaltiger Wirtszellen zu vermehren, erfordert eine koordinierte Nutzung endogener und vom Wirt stammender Nahrungsressourcen für die Membranbiogenese. Phosphatidylethanolamin ist das zweithäufigste Glycerophospholipid in T. gondii, aber wie sein Bedarf im akut infektiösen, sich schnell teilenden Tachyzoitenstadium gedeckt wird, bleibt rätselhaft. Diese Arbeit zeigt, dass der Parasit De-novo-Synthese- und Bergungswege nutzt, um seinen Bedarf an Ester- und Ether-gebundenem PtdEtn zu decken. Die Auxin-vermittelte Erschöpfung der Phosphoethanolamin-Cytidylyltransferase (ECT) verursachte bei Tachyzoiten einen letalen Phänotyp aufgrund einer beeinträchtigten Invasion und Zellteilung, was eine wichtige Rolle des CDP-Ethanolamin-Signalwegs während des Lysezyklus offenbart. Dementsprechend schien der innere Membrankomplex gestört zu sein, was mit einem Rückgang seiner Länge, Parasitenbreite und der wichtigsten Phospholipide einherging. Integrierte Lipidomik- und Isotopenanalysen der TgECT-Mutante enthüllten die endogene Synthese von Ester-PtdEtn und die Rettung ethergebundener Lipide aus Wirtszellen. Kurz gesagt, diese Studie zeigt, wie T. gondii verschiedene Mittel einsetzt, um unterschiedliche Formen von PtdEtn zu produzieren, und zeigt gleichzeitig die therapeutische Relevanz seiner De-novo-Synthese auf.

Der Protozoenstamm Apicomplexa umfasst viele häufig vorkommende intrazelluläre Krankheitserreger wie Toxoplasma, Plasmodium, Eimeria und Cryptosporidium. Toxoplasma gondii – die einzige bekannte Art der Gattung – hat die bemerkenswerte Fähigkeit, viele Arten kernhaltiger Zellen in verschiedenen Wirbeltieren zu infizieren; Es gilt daher als einer der erfolgreichsten Krankheitserreger. Die natürliche Infektion der Wirte durch T. gondii beginnt mit der Aufnahme der Oozysten oder Zysten in der kontaminierten Nahrung. Die aus der Oozyste bzw. Zyste freigesetzten Sporozoiten- und Bradyzoitenstadien infizieren das Magenepithel und entwickeln sich weiter zu einem hochinfektiösen, promiskuitiven und sich schnell teilenden Tachyzoitenstadium, das sich in anderen Geweben vermehrt und schließlich durch fortwährende Lysezyklen eine Nekrose verursacht1,2. Bei physikalisch-chemischem und immunologischem Stress differenzieren sich einige Tachyzoiten zu verkapselten Bradyzoiten, was zu einer chronischen Infektion führt. Für die intrazelluläre Reproduktion in Wirtszellen muss der Parasit über seine Synthese- und Salvage-Wege ausreichend Membranbiomasse produzieren, von denen viele hervorragende antiparasitäre therapeutische Ziele bieten3,4.

Glycerophospholipide bilden einen Hauptbestandteil der Biomembranen in Tachyzoiten von T. gondii4,5,6,7,8. Phosphatidylcholin (PtdCho), Phosphatidylethanolamin (PtdEtn), Phosphatidylthreonin (PtdThr), Phosphatidylserin (PtdSer), Phosphatidylinositol (PtdIns), Phosphatidylglycerin (PtdGro) und Phosphatidat (PtdOH) sind typische Phospholipide, die in Tachyzoiten vorhanden sind und für den optimalen Lysezyklus benötigt werden5,7 , 9,10,11,12. Neben ihrer üblichen Rolle bei der Parasitenreplikation haben sich viele Phospholipide in jüngster Zeit als Schlüsselakteure bei der Kalziumhomöostase und Signaltransduktion herausgestellt und tragen zur Gleitmotilität, Invasion und zum Austritt von Tachyzoiten bei7,12,13,14,15. Der Parasit ist in der Lage, Phospholipide mithilfe von Vorläufern zu synthetisieren, die aus der Wirtszelle stammen5,7,9,10,11,12,16,17,18,19. Darüber hinaus können bestimmte Phospholipidspezies/Sonden aus dem extrazellulären und/oder intrazellulären Milieu gerettet werden12,18,20.

PtdEtn ist das zweithäufigste Phospholipid in Tachyzoiten und liegt in Ester- und Ether-gebundenen Formen vor5,6,7. Es gibt verschiedene Wege, um Ester-PtdEtn zu produzieren, darunter verschiedene PtdSer-Decarboxylasen (PSDs), die sich im Mitochondrium und in der parasitophoren Vakuole des Parasiten befinden, CDP-Ethanolamin, auch bekannt als Kennedy-Weg, im endoplasmatischen Retikulum und über P4-ATPase-vermitteltes Umdrehen in der Plasmamembran5,10. 20,21. Seine endogene Synthese über den CDP-Ethanolamin-Weg erfordert ein Diacylglycerin-Gerüst, das von den Tachyzoiten erzeugt werden kann18. Obwohl in T. gondii noch nicht untersucht, enthält ethergebundenes PtdEtn ein Alkylglycerol-Rückgrat, das durch eine Alkylglyceronphosphat-Synthase in Säugetierzellen hergestellt wird22. In funktioneller Hinsicht trägt die konische Form von Ester-PtdEtn zur Membrankrümmung bei, reguliert die Knospungs-, Fusions- und Spaltungsereignisse und erleichtert dadurch die Membran-Protein-Wechselwirkungen . Andererseits ermöglicht die Form von Ether-PtdEtn eine stärkere intermolekulare Wasserstoffbindung zwischen Kopfgruppen, was zu einer verringerten Membranfluidität führt22,24.

Diese Arbeit untersuchte die Biogenese und physiologische Relevanz von Ester- und Ether-PtdEtn während des Lysezyklus von Toxoplasma-Tachyzoiten. Wir untersuchten die Phosphoethanolamin-Cytidylyltransferase (ECT), die von der Ethanolamin-Kinase abgeleitetes Phosphoethanolamin zu CDP-Ethanolamin im Zytosol des Parasiten katalysiert. Unsere Daten zeigen, dass die ECT für die asexuelle Reproduktion von Tachyzoiten in menschlichen Zellen unerlässlich ist. Sein bedingter Abbau durch Mutagenese beeinträchtigt die Menge und Synthese von Ester-PtdEtn-Spezies, während Ether-PtdEtn davon unberührt bleibt. Ebenso entdeckten wir, dass intrazelluläre Parasiten ethergebundenes PtdEtn aus den Wirtszellen retten können.

Unsere frühere Arbeit hat über das Auftreten eines funktionellen CDP-Ethanolamin-Signalwegs in den Tachyzoiten5 berichtet, obwohl wir keine potenzielle Alkylglyceronphosphat-Synthase im Parasitengenom identifizieren konnten. In den folgenden Studien haben wir die ersten und letzten Enzyme der De-novo-PtdEtn-Synthese beschrieben, nämlich Ethanolaminkinase (EK) und Ethanolaminphosphotransferase9,10. Hier haben wir das ECT-Protein identifiziert, das Phosphoethanolamin und CTP als Substrate zur Produktion von CDP-Ethanolamin25 verwendet. Durch den Vergleich mit Homologen der Modellorganismen Saccharomyces cerevisiae, Homo sapiens, Mus musculus und Trypanosoma brucei fanden wir eine potenzielle ECT im Toxoplasma-Genom (TGGT1_310280, Abb. 1). Im Gegensatz zu ECTs von Säugetieren und Kinetoplastiden, die etwa 400 Reste umfassen und separate Kladen bilden, sind Apicomplexan-Homologe viel länger und bilden ihre eigene Klade. PfECT und EfECT kodieren 573 bzw. 665 Reste, während TgECT 1128 Aminosäuren enthält. Apicomplexan-ECTs besitzen im Vergleich zu kanonischen Homologen eine ungewöhnliche N-terminale Verlängerung von >100 Resten. TgECT ist mit einer langen Ausdehnung von etwa 500 Aminosäuren außergewöhnlich und führt zu einem dreimal größeren Protein als seine nicht-apikomplexanen Gegenstücke (Abb. 1a).

a Primärstruktur und phylogenetische Nähe von Ethanolamin-Cytidylyltransferasen aus repräsentativen parasitären Protisten und Säugetierwirten. Die aus den Uniprot- oder NCBI-Datenbanken abgerufenen Proteinsequenzen wurden von Clustal W abgeglichen und das Phylogramm wurde mit der MEGA 11-Software erstellt (Maximum-Likelihood-Methode, JTT-Matrixmodell). Die Ausrichtung der ECTs ist in der ergänzenden Abbildung 1 zu sehen. b Ein dreidimensionales Homologiemodell der Cytidylyltransferase-Domänen in TgECT (rechts) und seine Überlagerung mit der Kristallstruktur von HsECT (grau, PDB: 3ELB, links). c Schema, das die 3′-genomische Markierung von TgECT mit einem smHA-Epitop zeigt. d Genomische PCR zur Bestätigung der Integration des smHA-Tags und des DHFR-TS-Selektionsmarkers am ECT-Locus. PCR1 und PCR2 wurden zum Testen des transgenen Locus verwendet, während PCR3 als Kontrolle für den Elternstamm einbezogen wurde. e Immunoblot, der die Expression von smHA-markiertem TgECT im transgenen Stamm zeigt. Das Sternchen (*) zeigt die korrekte TgECT-smHA-Bande (180 kDa). Andere Banden geringerer Größe sind mögliche Abbauprodukte von TgECT-smHA. f Immunfluoreszierende Co-Lokalisierung von TgECT-smHA mit TgALD in Tachyzoiten (24 Stunden nach der Infektion). Parasitierte Kulturen wurden mit α-HA- und α-TgALD-Antikörpern markiert.

TgECT beherbergt zwei Tandem-Cytidylyltransferase-Domänen mit etwa 100–150 Resten, die durch eine Linkerregion getrennt sind, analog zu seinen Gegenstücken in anderen Organismen. Dies steht im Gegensatz zum bakteriellen CTP: Glycerol-3-phosphat-Cytidylyltransferase oder eukaryotischen CTP: Phosphocholin-Cytidylyltransferase (CCT), das nur eine einzige CT-Domäne enthält. Das Sequenz-Alignment der typischen ECT-Domänen identifizierte auch konservierte Reste (ergänzende Abbildung 1). Alle Signaturmotive der Cytidylyltransferase-Familie sind in TgECT vorhanden: HSGH und HVGH; ein RTEGISTS-Motiv; KWVDEVI- und RVVDEVI-Regionen (ergänzende Abbildung 1). Homologiemodellierung von TgECT-Domänen basierend auf der HsECT-Struktur (PDB-Code, 3ELB) legt nahe, dass HSGH, HVGH und RTEGISTS an der Bildung eines katalytischen Zentrums beteiligt sind, während KWVDEVI und RVVDEVI die Dimerisierung der N- und C-terminalen CT-Domänen ermöglichen (Abb. 1b). Die N-terminale CT-Domäne in HsECT und PfECT ist entscheidend für ihre katalytische Aktivität26,27, was wahrscheinlich auch für TgECT zutrifft (Abb. 1a).

Der erste Schritt des CDP-Ethanolamin-Wegs zur Herstellung von Phosphoethanolamin findet im Zytosol statt9, und die dritte/letzte Reaktion zur Synthese von PtdEtn findet im endoplasmatischen Retikulum10 statt. Hier untersuchten wir die Lokalisierung von ECT, um den subzellulären Ort der CDP-Ethanolamin-Bildung zu entschlüsseln. Wir haben einen transgenen Parasitenstamm erzeugt, der ECT exprimiert und durch 3′-Genommarkierung an ein C-terminales Spaghettimonster (10xHA) fusioniert ist. Ein Donor-Amplikon mit den 5'- und 3'-Homologiesequenzen, die die Pyrimethamin-resistente DHFR-TS-Expressionskassette (Selektionsmarker) flankieren, wurde mit einem für Cas9 kodierenden CRISPR-Konstrukt und einer genspezifischen sgRNA in Tachyzoiten co-transfiziert (Abb. 1c). Die arzneimittelresistenten Parasiten wurden durch Grenzverdünnung kloniert und mittels genomischer PCR auf Integration am gewünschten Ort untersucht (Abb. 1d). Darüber hinaus bestätigten wir die erfolgreiche Markierung durch Western Blot und zeigten eine erwartete Bande von 180 kDa, die TgECT-smHA im transgenen, jedoch nicht im Elternstamm entspricht (Abb. 1e). Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte eine punktförmige Verteilung von ECT-smHA innerhalb des Parasiten, die zusammen mit einem bekannten zytosolischen Marker, der Aldolase (TgAld), lokalisiert war28,29 (Abb. 1f). Um die physiologische Relevanz von ECT während des Lysezyklus zu beurteilen, haben wir versucht, das Gen in Tachyzoiten durch CRISPR/Cas9-unterstützte doppelte homologe Rekombination zu löschen. Unsere zahlreichen Experimente zur Entwicklung einer lebensfähigen Knockout-Mutante waren jedoch erfolglos, was darauf hindeutet, dass dieses Protein für das Überleben von Tachyzoiten unverzichtbar ist.

In der folgenden Arbeit haben wir eine bedingte Mutante von TgECT hergestellt, die auf einem Auxin-induzierten Degron basiert und die markierten Proteine ​​bei Inkubation mit Indol-3-essigsäure (IAA) zum proteasomalen Abbau steuert30. Ein CRISPR/Cas9-Konstrukt, das Cas9 und sgRNA zur Spaltung des ECT-3′UTR kodiert, wurde mit einem Amplikon zur homologiegesteuerten Reparatur am Zielort in Tachyzoiten co-transfiziert. Die Donorsequenz enthielt 5'- und 3'-Homologiearme (jeweils 40 bp), die das AID-3xHA-Motiv für die 3'-Insertionsmarkierung und den DHFR-TS-Selektionsmarker flankierten (Abb. 2a). Die genomische Integration wurde durch PCR-Screening unter Verwendung von Crossover-spezifischen Primern untersucht (Abb. 2a, b), wodurch die 3′-Gen-Markierung bestätigt wurde, die durch DNA-Sequenzierung verifiziert wurde. In Übereinstimmung mit TgECT-smHA (Abb. 1f) war AID-3xHA-markiertes ECT im Zytosol vorhanden und kolokalisierte mit TgHSP90, einem anderen zytoplasmatischen Marker31 (Abb. 2c). Im Immunoblot wurde ein Protein von ∼180 kDa gefunden, das der mit AID-3xHA markierten ECT im transgenen Stamm entspricht, der ohne IAA kultiviert wurde, während das Signal innerhalb von 1 Stunde nach der IAA-Behandlung schnell erschöpft sein kann (Abb. 2d). Der schnelle Abbau von ECT durch IAA wurde durch einen Immunfluoreszenztest bestätigt (Abb. 2e, ergänzende Abb. 2).

a Das CRISPR/Cas9-vermittelte 3′-Tagging des TgECT-Gens mit einem Auxin-induzierbaren Degron und 3xHA. Das pU6-Cas9-TgECTsgRNA-Konstrukt (kodierend für Cas9 und ECT-spezifische sgRNA) wurde mit einem Donor-Amplikon (AID-3xHA-3′UTRGra1-DHFR-TS flankiert von 40 bp 5′/3′-Homologiearmen) in das transfiziert RHΔku80-Δhxgprt-TIR1-Elternstamm. Pyrimethaminresistente Tachyzoiten, die DHFR-TS exprimieren, wurden kloniert und mittels PCR gescreent. Der spätere Stamm TgECT-AID-3xHA ermöglichte eine bedingte Herunterregulierung der ECT durch Indol-3-Essigsäure (IAA). b Rekombinationsspezifische Screening-PCR zur Entschlüsselung der Integration von AID-3xHA am ECT-Locus (siehe Primer in a). PCR4/PCR5 und PCR6 zeigen die Prüfung transgener bzw. nativer Loci an. c Immunfluoreszenzbilder, die die Co-Lokalisierung von TgECT und TgHSP90 im Mutanten bestätigen. d, e IAA-abhängige Expression von AID-3xHA-markierter ECT, gezeigt durch Immunoblot- und Immunfluoreszenzmethoden. Die Parasiten wurden für die angegebenen Zeiträume in Abwesenheit oder Anwesenheit von 100 μM IAA kultiviert. Die Immunfärbung erfolgte mit den Antikörpern α-HA und α-TgHSP90 (d) oder α-HA und α-TgGAP45 (e). Die äquivalente Proteinmenge jeder Probe wurde zum Blotting auf 8 % SDS-PAGE aufgetrennt, gefolgt von einer Immunfärbung. f, g Plaques, produziert durch TgECT-AID-3xHA und Elternstämme (−/+IAA). Mit Kristallviolett gefärbte Bilder zeigen Plaques (unregelmäßige weiße Bereiche), die durch aufeinanderfolgende Lysezyklen der angegebenen Stämme in konfluenten HFF-Monoschichten (blau) gebildet wurden. Die von ImageJ quantifizierte Plaquegröße wird in willkürlichen Einheiten (au) angegeben. 150–200 Plaques jedes Stammes wurden bewertet (n = 3 Tests; Mittelwerte ± SE; ***p ≤ 0,001).

Eine bedingte Mutante ermöglichte es uns, die Bedeutung der ECT für den Lysezyklus des Parasiten in HFF-Zellen zu bewerten. Wir haben Plaque-Assays durchgeführt, die die allgemeine Wachstumsfitness von T. gondii anzeigen (Abb. 2f, g). Der Elternstamm zeigte ungeachtet der IAA in der Kultur ein normales Wachstum, ebenso wie die TgECT-AID-3xHA-Mutante in Abwesenheit von Auxin. Im Gegensatz dazu stoppte der IAA-induzierte Abbau von ECT das Parasitenwachstum, was durch das Fehlen von Plaques in der Monoschicht der Wirtszelle deutlich wird. Diese Ergebnisse stimmen mit der vorherigen Beobachtung überein, dass das ECT-Gen nicht gelöscht werden kann, was seine physiologisch entscheidende Rolle in T. gondii bestätigt.

Als nächstes untersuchten wir die Ursache eines letalen Phänotyps in ECT-depletierten Tachyzoitenkulturen durch zusätzliche Tests wie Replikation, Endodyogenese (Zellknospen), Austritt, Invasion und Gleitmotilität (Abb. 3). Für die ersten beiden Experimente wählten wir Zeitpunkte, die frühen (24 Stunden) und späten (40 Stunden) parasitierten Kulturen entsprachen (Abb. 3a, b). Die Replikation wurde quantifiziert, indem „Parasiten pro Vakuole“ gezählt und der Anteil der Vakuolen mit unterschiedlicher Anzahl an Nachkommen berechnet wurde. Im Gegensatz zum Elternstamm, der von IAA nicht betroffen war, wies die ECT-Mutante zu beiden Zeitpunkten in mit Auxin behandelten Kulturen einen viel höheren Anteil kleiner Vakuolen (1–8 Parasiten) auf als unbehandelte Proben (Abb. 3a). Die großen Vakuolen mit >16 Parasiten waren unter ECT-depletierten Bedingungen im Gegensatz zu den Kontrollkulturen kaum vorhanden. Übereinstimmend zeigte die Bewertung der Endodyogenese nur bei der IAA-behandelten TgECT-AID-3xHA-Mutante eine stark beeinträchtigte Tochterzellbildung (Abb. 3b).

a, b Die Replikation und die Knospungseffizienz der TgECT-AID-3xHA- und Elternstämme (-/+IAA). Mit TgGAP45 gefärbte Tachyzoiten, die sich in Vakuolen replizierten, wurden aufgetragen (Parasiten/Vakuole), um die Proliferationsrate jedes Stamms (a) widerzuspiegeln. Ein vereinfachtes Balkendiagramm mit Datenpunkten finden Sie in der ergänzenden Abbildung 6. Die Knospung von Tochterzellen wurde auf der Grundlage der Quantifizierung von TgIMC3-positiven Vakuolen berechnet, die Tachyzoiten mit Nachkommen beherbergen (b). Die Balkendiagramme basieren auf 400–500 Vakuolen für jede Probe. c, d Austrittsraten der ECT-Mutante und der Elternstämme unter −/+ IAA-Bedingungen. Für den natürlichen (c) und Zaprinast-induzierten (d) Austritt wurden Ergebnisse durch Zählen von 30 Zufallsfeldern mit >200 parasitophoren Vakuolen erzielt. e Invasionseffizienz der angegebenen Stämme (−/+IAA). Für die angezeigten Balkendiagramme wurden insgesamt >1000 Ereignisse bewertet. f Gleitmotilität von Tachyzoiten. Mit TgSAG1 gefärbte Parasiten wurden auf die bewegliche Fraktion (200–400 Zellen, n = 4 Tests) und die Spurenlänge (> 60 Spuren pro Gruppe, mit Ausnahme von IAA-behandeltem TgECT-AID-3xHA (13 Spuren)) analysiert. g Die Ausbeute an Tachyzoiten (−/+IAA). HFF-Monoschichten (106 Zellen) wurden mit den angegebenen Stämmen infiziert (MoI = 1) und 48 Stunden lang mit oder ohne IAA kultiviert, gefolgt von einer Parasitenzählung. Die (a–g) zeigen Daten von n = 3 oder mehr Experimenten (Mittelwerte ± SE; *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001).

Der bedingte Mutant zeigte auch einen Defekt im natürlichen Austritt nach Abschluss der Tachyzoitenreplikation (Abb. 3c). Wir haben den induzierten Austritt als Reaktion auf Zaprinast bewertet, um zu testen, ob der beobachtete Phänotyp auf eine langsame Replikation und nicht auf eine beeinträchtigte Austrittssignalisierung zurückzuführen ist. Dieser wirksame Phosphodiesterase-Inhibitor löst einen vorzeitigen Austritt intrazellulärer Tachyzoiten aus, indem er die cGMP-Signalisierung aktiviert32,33. Tatsächlich wurde der Egress-Phänotyp durch Zaprinast gerettet (Abb. 3d), was eine integrale Signalkaskade impliziert. Bemerkenswerterweise drangen ECT-depletierte Parasiten nur sehr schlecht in Wirtszellen ein (Abb. 3e), was darauf hindeutet, dass der Mutant nicht in der Lage ist, eine neue Infektion zu etablieren. Da der Invasionsprozess durch die Gleitmotilität vorangetrieben wird, haben wir den letztgenannten Phänotyp untersucht (Abb. 3f). Unsere Daten zeigten einen deutlichen Rückgang der beweglichen Fraktion und der Spurenlänge der IAA-exponierten Mutante, jedoch nicht in Kontrollproben. Die beobachteten Defekte in der Motilität, Invasion und Replikation des Parasiten gipfelten in einer stark verringerten Proliferation des mit Auxin inkubierten bedingten Mutanten. Die Tachyzoitenzahl (Parasitenertrag) sank bei der IAA-Behandlung im Vergleich zu den Kontrollkulturen um etwa 90 % (Abb. 3g).

Die Apikomplexan-Motilität und die fortbewegungsabhängigen Invasions- und Austrittsereignisse werden durch einen Aktin-Myosin-Motor (Glideosom) angetrieben, der in den inneren Membrankomplex (IMC) eingebettet ist34. Die Färbung der Tochterzellen (Abb. 3b) deutete auf eine Fehlfunktion der Organelle hin, die wir durch die Visualisierung von TgGAP45 – einem gut charakterisierten Protein, das für die Glideosomenfunktion35,36 essentiell ist – in Tachyzoiten des TgECT-AID-3xHA-Stamms untersuchten (Abb. 4a). ). Die Kultivierung von Mutanten mit IAA über 24 und 48 Stunden führte im Vergleich zum Elternstamm zu deutlich schmaleren und verkürzten Parasiten (Abb. 4a). Um unsere Beobachtung zu festigen, haben wir die Länge und Breite des TgGAP45-markierten IMC gemessen. Zu beiden Zeitpunkten nach der IAA-Behandlung wurde eine signifikante Abnahme dieser beiden Dimensionen festgestellt. Während die Länge des IMC um 10 % schrumpfte (Abb. 4b), verringerte sich die Breite der Tachyzoiten um 25 %, wenn sie Auxin ausgesetzt wurde (Abb. 4c). Unter der Annahme, dass ECT einen Beitrag zur Membranbiogenese leistet, haben wir durch Immunfärbung auch andere Organellen wie Mikroneme (MIC2), Plasmamembran (SAG1), Apikoplasten (Ferredoxin) und Mitochondrien (HSP60) sichtbar gemacht (ergänzende Abbildung 2). In keinem der immungefärbten Organellen war eine morphologische Anomalie erkennbar. Wir haben auch Transmissionselektronenmikroskopie eingesetzt, um die potenziellen Organellendefekte in der TgECT-abgereicherten Mutante (ergänzende Abbildung 3) zu entschlüsseln, die im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle oder dem Elternstamm (-/+IAA) keinen ausgeprägten Phänotyp aufwies, und so unsere Ausgangslage zu ermitteln Befunde durch indirekte Immunfluoreszenztests.

a Tachyzoiten des Stamms TgECT-AID-3xHA wurden kultiviert (–/+ IAA), gefolgt von einer Immunfärbung mit TgGAP45. Kerne wurden durch DAPI visualisiert. b, c Die Länge von IMC und die Breite von Tachyzoiten in den transgenen und Elternstämmen nach Kultivierung mit oder ohne Auxin für 24 und 48 Stunden. Bilder von 30 parasitophoren Vakuolen mit jeweils 4 Tachyzoiten wurden von ImageJ analysiert, um die angegebenen Parameter zu berechnen (n = 3 Tests, Mittelwerte ± SE; ***p ≤ 0,001).

Angesichts der mutmaßlichen Rolle von ECT bei der PtdEtn-Synthese führten wir eine Lipidomanalyse der TgECT-AID-3xHA- und Elternstämme durch (Abb. 5). Die Gesamtlipide wurden aus Parasiten isoliert, aufgetrennt und mittels HPLC-MS analysiert. Im Vergleich zu den Eltern- und unbehandelten Mutantenkontrollen beobachteten wir einen Rückgang des Phospholipidgehalts des ECT-depletierten Stamms um etwa 50 % (Abb. 5a). Es wurde ein signifikanter Rückgang aller wichtigen Phospholipidklassen der mit IAA behandelten Mutanten beobachtet, wohingegen beim Elternstamm keine Veränderung erkennbar war (Abb. 5b). Die Häufigkeit der gezeigten Lipide sank bei ECT-Erschöpfung um 30–50 %. Wir haben auch die Konzentrationen des Ester- und Ether-gebundenen PtdEtn gemessen (Abb. 5c). In −/+ IAA-Kulturen des Elternstamms wurden keine Veränderungen festgestellt. Ein Abbau von ECT in der Mutante führte zu einem Rückgang von Ester-PtdEtn, jedoch nicht von Ether-Lipid (Abb. 5c). Daher wurde das Verhältnis von Ester zu Ether-PtdEtn von 2,6:1 in unbehandelten Kulturen auf 1,1:1 in der ECT-abgereicherten Mutante geändert.

a Vergleichender Phospholipidgehalt von TgECT-AID-3xHA und Elternstämmen. Die Parasiten wurden kultiviert (–/+IAA), gefolgt von einer Lipidomanalyse (n = 4 Tests). Die relative Häufigkeit jedes Phospholipids in IAA-behandelten Proben wird im Vergleich zur unbehandelten Kontrollkultur (−IAA, 100 %) dargestellt. b Relative Häufigkeit von Standard-Phospholipidklassen in Tachyzoiten der angegebenen Stämme (−/+IAA). c Veränderungen in Ester- und Ether-verknüpften PtdEtn-Pools der mutierten und parentalen Tachyzoiten. Die Daten in (a–c) zeigen die Mittelwerte mit SE (n = 4 Tests). Die statistische Signifikanz wurde durch Vergleich der +IAA- und −IAA-Proben berechnet (**p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001).

Als nächstes haben wir das Ausmaß der Veränderung aller nachweisbaren Phospholipidspezies unabhängig von der Häufigkeit als Vulkandiagramme aufgetragen, um die Faltungsänderung gegenüber der statistischen Signifikanz bei IAA-induziertem ECT-Verlust zu veranschaulichen (Abb. 6a, b). Keine der Lipidspezies im Elternstamm war über einem Schwellenwert von ≥ 2-fach (p-Wert ≤ 0,01) betroffen (Abb. 6a). Der TgECT-AID-3xHA-Stamm hingegen zeigte eine erhebliche Regulierung mehrerer Lipidspezies, die PtdCho, PtdEtn, PtdIns, PtdSer, PtdThr, Lyso-PtdCho und Lyso-PtdIns entsprechen (Abb. 6b, ergänzende Abb. 4–5). ). Unter den herunterregulierten Esterphospholipiden waren PtdEtn-, PtdSer- und PtdThr-Spezies am deutlichsten zu erkennen (Abb. 6b). Einige andere, nämlich C36:1, C38:4, C40:5 PtdEtn, C42:5 PtdSer, C36:4, C38:1 PtdCho und C20:4 lyso-PtdIns, wurden hochreguliert. Interessanterweise waren Ether-Lipide, die einzeln zu PtdEtn und PtdCho gehören, in der Mutante hochreguliert oder unverändert (Abb. 6b, 7a).

a Vulkandiagramme der Eltern- und TgECT-AID-3xHA-Stämme (unten), um Veränderungen in einzelnen Phospholipidspezies bei IAA-Exposition darzustellen. Zur Identifizierung signifikant veränderter Lipide (n = 4 Tests) wurden definierte Schwellenwerte für die Faltungsänderung (≥ 2x) und der durch die Falscherkennungsrate korrigierte p-Wert (≤ 0,01) verwendet. Kreise unterschiedlicher Größe, die einzelne Arten kennzeichnen, sind auf die Häufigkeit skaliert; diejenigen, die über dem angegebenen Schwellenwert liegen, werden entsprechend der Phospholipidklasse gefärbt, während andere grau dargestellt werden. b Heatmaps, die Veränderungen in den aus (a) ausgewählten Lipidspezies zeigen. Der Präfixbuchstabe „A“ gibt die Ätherform von PtdCho und PtdEtn an. Lipidomics-Daten sind in den Excel-Tabellen verfügbar (Ergänzungsdatenblatt 1–2).

a Die relative Häufigkeit ester- und ethergebundener PtdEtn-Spezies veränderte sich bei der Behandlung von TgECT-AID-3xHA mit IAA signifikant (Abb. 6). b Schema für die stabile Isotopenmarkierung extrazellulärer und intrazellulärer mutierter TgECT-AID-3xHA-Tachyzoiten (−/+IAA) mit [13C2]-Ethanolamin bzw. vom Wirt stammendem [13C2]-PtdEtn. Für den letztgenannten Test wurden HFFs in [13C2]-Ethanolamin kultiviert, um PtdEtn zu markieren, gefolgt von der Vermehrung von Tachyzoiten, um die Rettung von [13C2]-PtdEtn zu testen. Der Einbau von [13C2] in Ester- und Ether-PtdEtn-Spezies gereinigter Parasiten wurde durch Lipidomanalyse beurteilt. c, d Anreicherung von [13C2]-Ethanolamin in Ester- und Ether-verknüpften PtdEtn-Spezies extrazellulärer und intrazellulärer Tachyzoiten, wie in (b) beschrieben. Die Daten in (a, c, d) zeigen die Mittelwerte mit SE (a, n = 4 Tests; c, d, n = 5 Tests).

Die miteinander verbundene Synthese von Phospholipiden motivierte uns, Muster in ihrer Co-Regulation zu finden. Ein Verlust von ECT veränderte mehrere Arten, insbesondere diejenigen, die PtdSer, PtdThr und PtdEtn gemeinsam haben. C34:2, C38:6, C38:7, C40:7 PtdSer und C38:6, C38:7 PtdThr entsprachen dem Trend zu PtdEtn-Spezies (ergänzende Abbildung 4), was auf ihre Synthese durch die Basenaustausch-PSS- und PTS-Enzyme schließen lässt in T. gondii7. Es gab kaum eine gemeinsame PtdEtn- und PtdCho-Spezies (Abb. 6b), was das Fehlen einer Lipid-Methyltransferase5 bestätigt. Ebenso wurde keine Korrelation von PtdEtn-Spezies mit PtdIns beobachtet, wie aufgrund der souveränen Synthesewege erwartet12,25. Bemerkenswerterweise wurden einige Arten von PtdCho (36:4, 38:1), PtdEtn (36:1, 38:4, 40:4, 40:5) und PtdSer (42:5) in der Mutante ohne ECT induziert ( Ergänzende Abbildung 3b), die auf einen Ausgleichsmechanismus hinweist. Keine der angegebenen PtdEtn-Arten war jedoch in extrazellulären Tachyzoiten oder in solchen, die in vormarkierten Wirtszellen gezüchtet wurden, mit 13C2 markiert (Abb. 7b, c, siehe unten). Solche Ester-PtdEtn-Spezies werden daher wahrscheinlich von PSDs gebildet10,21.

Im Gegensatz zu seiner Esterform waren die Ether-PtdEtn-Spezies erhöht oder nicht betroffen (Abb. 7a), was uns dazu veranlasste, die Enzyme der Ether-PtdEtn-Synthese in T. gondii zu suchen. Wie oben erwähnt, konnte unsere bioinformatische Analyse keinen geeigneten Kandidaten im Parasitengenom finden. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass der Kennedy-Weg das estergebundene PtdEtn bereitstellt und die Produktion von Etherlipiden vom Milieu des Parasiten abhängt. Um diese Prämisse zu testen, führten wir eine Isotopenmarkierung (13C2-Ethanolamin) durch, gefolgt von einer Lipidomanalyse, die es uns ermöglichte, die vom Parasiten synthetisierten PtdEtn-Spezies von denen zu unterscheiden, die aus den Wirtszellen gewonnen wurden (Abb. 7b). Ähnlich wie bei der zuvor berichteten 13C6-myo-Inositol-Markierung von PtdIns12 wurden mit 13C2-Ethanolamin markierte wirtsfreie Parasiten analysiert, um das endogen hergestellte PtdEtn zu erkennen. Gleichzeitig wurden in vormarkierten Wirtszellen kultivierte Tachyzoiten eingesetzt, um das Auftreten eines Salvage-Weges abzuleiten.

Die Lipidomanalyse der extrazellulären Parasiten ergab eine Anreicherung von 13C2-Ethanolamin in mehreren Ester-PtdEtn-Spezies, wie C34:1 (>5-fach), C34:2 (∼11x), C36:2 (∼10x), C38:4 (∼6x) und C40:5 (∼6x) (Abb. 7c), was das Vorhandensein eines funktionellen CDP-Ethanolamin-Weges bestätigte 5,10. Der IAA-vermittelte ECT-Abbau beeinträchtigte die Isotopenmarkierung der C34:1-, C34:2- und C36:2-Spezies, was mit dem beobachteten Rückgang ihres Gehalts übereinstimmt (Abb. 7a). Im Gegensatz dazu wurde die 13C2-Markierung von C38:4 und C40:5 PtdEtn durch IAA nicht beeinflusst (Abb. 7c), entsprechend ihren ungestörten oder erhöhten Werten (Abb. 7a). Tachyzoiten, die in 13C2-Ethanolamin-markierten Wirtszellen gezüchtet wurden, zeigten bei keiner der Ester-PtdEtn-Spezies eine Isotopenanreicherung, was eine Rettung dieser Lipide ausschließt (Abb. 7c). Umgekehrt beobachteten wir ein gegenteiliges Phänomen bei Ester-PtdEtn-Spezies (A34:2, A36:5), die in intrazellulär gewachsenen, aber nicht in wirtsfreien Parasiten mit 13C2 angereichert waren (∼4–5x) (Abb. 7d). Andere Lipidspezies (A38:5, A38:6, A40:6) wurden unter beiden Einstellungen gleichermaßen markiert (∼2–3x), und wie erwartet wurde bei Erschöpfung von ECT keine Änderung der 13C2-Markierung von Ether-PtdEtn beobachtet. Die Daten deuten darauf hin, dass Ester-PtdEtn-Spezies hauptsächlich de novo über den CDP-Ethanolamin-Weg synthetisiert werden, während der Parasit ethergebundene PtdEtn-Spezies aus seiner Wirtszelle rettet.

Das Verständnis der metabolischen Grundlagen des intrazellulären Parasitismus bei Apicomplexan-Parasiten war von zentraler Bedeutung für die Erreger-Wirt-Forschung. In den letzten drei Jahrzehnten hat sich Toxoplasma gondii zu einem Modellparasiten für die Entdeckung der Apicomplexan-Biologie entwickelt, da die Kultur relativ einfach ist und fortschrittliche Werkzeuge für die Gentechnik und Mutantenphänotypisierung zur Verfügung stehen. Obwohl aktiv untersucht, werden Lipidbiosynthese, Lipidtransport, -gewinnung, -erkennung und -signalisierung in Apicomplexa immer noch wenig geschätzt. Diese Arbeit untersuchte eine Phosphoethanolamin-Cytidylyltransferase (ECT) und stellte fest, dass Tachyzoiten von T. gondii unterschiedliche Wege nutzen, um ihren Bedarf an der Ester- und Ether-gebundenen PtdEtn-Spezies zu decken (Abb. 8). Während die ersteren Lipide über den Kennedy-Weg erzeugt werden, wird der zweite Typ aus den Wirtszellen gewonnen. ECT ist ein essentielles Protein, das die Invasion und Replikation von Parasiten während des Lysezyklus erleichtert. Diese Merkmale und seine phylogenetische Abweichung von den Säugetierhomologen machen TgECT zu einem hervorragenden Wirkstoffziel für die therapeutische Hemmung der akuten Toxoplasmose.

Das Modell basiert auf dieser Arbeit und den hier zitierten früheren Arbeiten. Tachyzoiten nutzen mehrere Wege, um PtdEtn zu produzieren. Der Bedarf an Ester-PtdEtn wird hauptsächlich über die Wege CDP-Ethanolamin und PSD1mt gedeckt. Ersteres treibt die De-novo-Synthese von Ester-PtdEtn im ER voran, während letzteres PtdEtn durch Decarboxylierung von PtdSer im Mitochondrium erzeugt. ECT befindet sich im Cytosol des Parasiten und ist das zweite und geschwindigkeitsbestimmende Enzym der CDP-Ethanolamin-Route. Es ist für das Überleben des Parasiten essentiell und sein bedingter Abbau in der TgECT-AID-3xHA-Mutante durch IAA führt zu einem Rückgang vieler PtdEtn-, PtdSer- und PtdThr-Arten. Die beiden letztgenannten Lipide werden wahrscheinlich aus PtdEtn über Basenaustauschreaktionen hergestellt, die von PSS- und PTS-Enzymen im ER gesteuert werden. Der Verlust der ECT beeinträchtigt den inneren Membrankomplex, was zu Defekten in der Gleitmotilität, Invasion und Zellteilung führen kann. Der Bedarf des Parasiten an ethergebundenem PtdEtn wird durch die Rettung aus der Wirtszelle gedeckt. Ob intrazelluläre Tachyzoiten PSD1pv-abgeleitetes Ester-PtdEtn importieren, ist unklar. P4-ATPasen, die sich auf der Parasitenoberfläche befinden, könnten beim Umdrehen von ether- und estergebundenem PtdEtn eine Rolle spielen.

Unsere Arbeit legt die Rolle des CDP-Ethanolamin-Weges bei der Herstellung von Ester-PtdEtn nahe. Die Konzentrationen vieler Ester-PtdEtn-Spezies waren in der ECT-Mutante reduziert. Die ungestörten und hochregulierten Mengen anderer spezifischer Lipide weisen auf das funktionelle Vorhandensein und den Beitrag zusätzlicher Wege hin. Ester-PtdEtn kann durch PSD1mt und PSD1pv erzeugt werden (Abb. 8)10,21. Darüber hinaus sind zumindest die extrazellulären Tachyzoiten in der Lage, PtdEtn15,20 zu retten, und es ist plausibel, dass sie, wenn sie intrazellulär sind, von PtdSer abgeleitetes PtdEtn erwerben können, das in der parasitophoren Vakuole durch Katalyse von PSD1pv hergestellt wird. Schließlich sind das endoplasmatische Retikulum des Wirts und die auf der Vakuolenmembran rekrutierten Mitochondrien die Hauptstandorte der PtdSer- und PtdEtn-Synthese in Säugetierzellen und dienen möglicherweise als zusätzliche Quelle dieser Lipide. Interessanterweise können die PSD1mt-Knockout-Tachyzoiten in längeren Kulturen überleben und eine Hochregulierung des CDP-Ethanolamin-Wegs zeigen;10 Das Gegenteil scheint jedoch nicht der Fall zu sein, da ECT für den Lysezyklus essentiell ist. Wir schlagen vor, dass unterschiedliche Reaktionen die Synthese diskreter Ester-PtdEtn-Spezies vorantreiben und dass die durch den Kennedy-Weg kodierten Reaktionen nicht auf andere Weise ausgeglichen werden können, was zu einem tödlichen Phänotyp in der ECT-Mutante führt.

Die physiologische Relevanz des Kennedy-Signalwegs wurde auch bei anderen parasitären Protisten untersucht, darunter T. brucei und P. bergei37,38. Es wird berichtet, dass die zugrunde liegenden Enzyme für diese Parasiten essentiell sind, obwohl sie funktionelle PSD-Enzyme enthalten. Die Erschöpfung von TbECT beeinträchtigte die Parasitenvermehrung, was mit einem verringerten PtdEtn-Gehalt und einer ungewöhnlichen Morphologie bei T. brucei korrelierte37. Diese Ergebnisse spiegeln den Phänotyp der ECT-depletierten Tachyzoiten von T. gondii wider. Der bedingte Verlust von TgECT verhinderte die Invasion und Replikation des Parasiten, gleichzeitig mit einer abnormalen IMC, die auf eine fehlregulierte Phospholipidzusammensetzung (möglicherweise PtdEtn-Arten) zurückzuführen ist. IMC beherbergt das Glideosom, einen Motorkomplex, der die Motilität des Parasiten antreibt34 und ist für den Lysezyklus von entscheidender Bedeutung. Seine Störung bei Verlust von TgECT kann zu einer Dysfunktion des Glideosoms führen, was zu einer beeinträchtigten Motilität, Invasion und Austritt bei Tachyzoiten führt. Darüber hinaus kann ein verzerrtes Verhältnis von Ester- zu Ether-gebundenem PtdEtn in der Mutante die Membranflüssigkeit und Zytokinese beeinflussen, wie in Säugetierzellen beschrieben23.

Unsere Daten legen auch nahe, dass PtdEtn als Donor für die Synthese von PtdSer und PtdThr über eine durch PSS- bzw. PTS-Proteine ​​katalysierte Ethanolamin-zu-Serin- oder Threonin-Austauschreaktion dient (Abb. 8). Bemerkenswerterweise blieben einige PtdEtn-Arten (36:1, 38:4, 40:4, 40:5) bei Erschöpfung des ECT unverändert oder erhöhten sich sogar. Sie werden wahrscheinlich durch PtdSer-Decarboxylierung hergestellt, was eine Lipidomanalyse der PSD1mt- und PSD1pv-Mutanten erfordert. In der Modulation der PtdCho- und PtdIns-Spezies mit der von PtdEtn waren keine Parallelen erkennbar, was mit den unabhängigen Synthesewegen für die beiden erstgenannten Phospholipide übereinstimmt4,5,12. Wichtig ist, dass diese Studie die Rettung von vom Wirt stammenden Ether-PtdEtn-Spezies durch intrazelluläre Parasiten zeigt (Abb. 8). Während Tachyzoiten bekanntermaßen Diacylglycerin zur Herstellung von Ester-PtdEtn18 produzieren, konnte im Genom des Parasiten keine echte Alkylglyceronphosphat-Synthase zur Herstellung des Alkylglycerin-Gerüsts von Ether-PtdEtn gefunden werden. Das Vorhandensein ethergebundener Lipide in Tachyzoiten ist rätselhaft. Berichten zufolge haben sie „Redox“-Effekte in Säugetierzellen22,24. Bestimmte kultivierte Zellen, denen sie fehlen, werden empfindlicher gegenüber oxidativen Schäden. Ebenso wurde die prooxidative Wirkung dieser Lipide beschrieben39. Zukünftige Arbeiten sollten sich auf die Analyse der Bergungsmaschinerie und der funktionellen Bedeutung von Etherlipiden in Tachyzoiten von T. gondii konzentrieren.

Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass TgECT ein lebenswichtiges Enzym ist, das zur Synthese von Ester-PtdEtn beiträgt. Seine bedingte Erschöpfung beeinträchtigt die Membranbiogenese, Replikation und Invasion in Tachyzoiten. Wir zeigen ein Zusammenspiel von endogenen Synthese-, gegenseitigen Umwandlungs- und Bergungswegen zur Herstellung von PtdEtn auf. Insbesondere zeigen die Daten ein bisher unbekanntes Abfangen von ethergebundenen PtdEtn-Spezies aus dem Wirt durch den Parasiten und bieten eine solide Grundlage für die therapeutische Ausrichtung der PtdEtn-Synthese in T. gondii.

Der RH∆ku80∆hxgprt-TIR1-Stamm von T. gondii, das pLinker-AID-3xHA-HXGPRT-Plasmid für die AID-3xHA-Markierung40, die Anti-TgALD- und Anti-TgMIC2-Antikörper wurden von David Sibley (Washington University, St. Louis, USA). Weitere primäre Antikörper, die an TgGAP45, TgHSP90, TgIMC3 und TgFerredoxin binden, wurden von Dominique Soldati-Favre (Universität Genf, Schweiz), Sergio O. Angel (IIB-INTECH, Argentinien), Marc-Jan Gubbels (Boston College, USA) angeboten. und Frank Seeber (Robert-Koch-Institut, Berlin). Primärantikörper gegen TgHSP60 und das Schweine-Anti-Tg-Serum wurden im State Key Laboratory of Agricultural Microbiology (Wuhan, China) hergestellt. Weitere primäre Antikörper gegen das Hämagglutinin (HA)-Epitop und TgSAG1 wurden von Sigma-Aldrich (Deutschland) bzw. ThermoFisher Scientific (Deutschland) erhalten. Die Sekundärantikörper für die Immunfärbung (Alexa488, Alexa594, IRDye 680RD, 800CW) und Oligonukleotide (Ergänzungstabelle 1) wurden von Life Technologies (Deutschland) bezogen. Die Zellkulturreagenzien wurden von PAN Biotech (Deutschland) bezogen. Weitere Standardchemikalien wurden von Sigma-Aldrich und Carl Roth (Deutschland) geliefert. Die Reagenzienkits zum Klonen wurden von Analytik Jena und Life Technologies (Deutschland) erworben. Lipidstandards wurden von Avanti Polar Lipids (USA) geliefert.

Als Wirtszellen zur Vermehrung von Tachyzoiten von T. gondii wurden menschliche Vorhautfibroblasten (HFFs) verwendet. Die Zellen wurden durch Trypsinisierung (0,25 % Trypsin-EDTA) geerntet und je nach den Anforderungen der einzelnen Tests in Kolben, Schalen oder Deckgläser ausgesät. Die konfluenten Monoschichten wurden an wechselnden Tagen infiziert, um die Tachyzoiten aufrechtzuerhalten. Die Kulturen wurden in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) durchgeführt, ergänzt mit Glucose (4,5 g/L), fötalem Rinderserum (10 %, PAN Biotech, Deutschland), Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM), Penicillin (100). U/ml), Streptomycin (100 μg/ml) und minimale nicht-essentielle Eagle-Aminosäuren (jeweils 100 μM) bei 37 °C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator. Bei den meisten Tests wurden Tachyzoiten aus parasitierten Kulturen im Spätstadium durch Schaben und Spritzen durch 23- und 27-Gauge-Spritzen freigesetzt. Die extrazellulären Parasiten wurden direkt für nachgelagerte Tests verwendet.

Tachyzoiten (~107) wurden mit 10 µg Plasmidkonstrukten in filtersterilem Zytomix (120 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 10 mM K2HPO4/KH2PO4, 25 mM HEPES, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, ergänzt mit frischem 5 mM Glutathion) transfiziert 5 mM ATP; pH 7,6). Anschließend wurden die Parasiten mit dem Medikament selektiert, das dem vom transfizierten Plasmid kodierten Selektionsmarker entsprach. Die arzneimittelresistenten transgenen Parasiten wurden durch limitierende Verdünnung in 96-Well-Platten mit HFF-Zellen kloniert. Einzelne Klone mit gewünschter Genmanipulation wurden durch Screening-PCR und Immunfärbungstests identifiziert. Um den TgECT-AID-3xHA-Stamm zu erzeugen, wurde ein Spenderamplikon co-transfiziert, das den Selektionsmarker AID-3xHA-TgGRA1-3'UTR und DHFR-TS enthielt, flankiert von kurzen (40 bp) homologen Armen für einen Crossover am ECT-Locus mit einem CRISPR-Cas9-Konstrukt im Stamm RH∆ku80∆hxgprt-TIR1. Um den TgECT-smHA-Stamm zu erzeugen, wurde ein Plasmidkonstrukt, das Cas9 und TgECT-spezifische sgRNA exprimiert, mit einem PCR-Amplikon transfiziert, das 10xHA und DHFR-TS-Expressionskassette im RHΔku80-hxgprt−-Stamm umfasst. Die mutierten Parasiten wurden mit 1 µM Pyrimethamin selektiert und einem PCR-Screening auf die AID-3xHA- oder smHA-Markierung von ECT unterzogen.

Der Test wurde wie bereits berichtet41 durchgeführt. HFF-Zellen wurden ausgesät und bis zur Konfluenz auf den in 24-Well-Platten platzierten Glasdeckgläsern gezüchtet. Zur Infektion von HFF-Monoschichten wurden frisch freigesetzte Parasiten verwendet. Parasitierte Wirtszellen wurden mit PBS gewaschen und 15 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert, gefolgt von einer Neutralisierung in 0,1 M Glycin/PBS. Die Proben wurden mit 0,2 % Triton-X100/PBS permeabilisiert (20 Min.) und mit 2 % BSA, hergestellt in 0,2 % Triton-X100/PBS, blockiert (20 Min.). Die Zellen wurden schließlich mit dem passenden Primärfarbstoff (α-HA, 1:3000; α-TgGAP45, 1:5000; α-TgIMC3, 1:2000; α-TgALD, 1:1000; α-TgFerredoxin, 1:500; TgSAG1) gefärbt , 1:1000; Anti-Tg-Schweineserum, 1:1000, TgMIC2, 1:1000) und sekundäre (Alexa488, Alexa594, 1:3000) Antikörper für jeweils 1 Stunde. Die Proben wurden zwischen verschiedenen Behandlungsschritten mit PBS gewaschen und zur Bildgebung in DAPI-Fluoromount G montiert (Carl-Zeiss, Deutschland).

Phänotypische Tests wurden mit frischen Parasiten durchgeführt, die mit einer Spritze freigesetzt wurden, wie bereits berichtet7,12,32. Kurz gesagt wurden Plaque-Assays in Platten mit 6 Vertiefungen durchgeführt, indem konfluente HFF-Monoschichten mit 200 Parasiten/Vertiefung infiziert wurden, gefolgt von einer ungestörten Inkubation (–/+ 100 µM IAA in 0,1 % Ethanol) für 7 Tage. Das Trägerlösungsmittel war in unbehandelten Proben enthalten. Die Kulturen wurden mit kaltem Methanol fixiert (15 Min.) und mit Kristallviolett gefärbt (15 Min.). Plaques wurden mit der ImageJ-Suite (NIH, Bethesda) quantifiziert. Für Replikations- und Endodyogenietests wurden die konfluenten HFF-Monoschichten auf Deckgläsern infiziert (MoI: 1, 24 h, 40 h), gefolgt von einer Fixierung und Färbung mit α-TgIMC3- und α-TgGAP45-Antikörpern. Die Zellteilung wurde durch Zählung der Parasiten beurteilt, die sich in ihren parasitophoren Vakuolen replizierten. Um die Gleitmotilität zu bestimmen, wurden Tachyzoiten 48 Stunden lang mit IAA vorkultiviert (falls zutreffend). Anschließend wurden 4 × 105 Parasiten, suspendiert in Ca2+-freier Hank's ausgewogener Salzlösung (–/+ IAA), abgesetzt (400 g, 5 Min., Raumtemperatur), gefolgt von einer Inkubation (15 Min., 37 °C) auf mit 0,01 beschichteten Deckgläsern % BSA. Um die Parasiten und Spuren sichtbar zu machen, wurden die Proben mit α-TgSAG1- und Alexa488-Antikörpern gefärbt. Die beweglichen Fraktionen wurden direkt am Mikroskop geschätzt, während die Spurlängen mit der ImageJ-Software quantifiziert wurden.

Für den Invasionstest wurden Tachyzoiten 40 Stunden lang in 100 µM IAA oder dem Trägerlösungsmittel vorkultiviert und dann zur Infektion der Wirtszellen auf Deckgläsern verwendet (MoI: 10, 1 Stunde). Die Proben wurden fixiert, neutralisiert und gefärbt, wie an anderer Stelle berichtet32. Die nicht eingedrungenen (extrazellulären) Parasiten wurden vor der Permeabilisierung der Kulturen durch Detergens auf TgSAG1 immungefärbt. Die Proben wurden mit PBS gewaschen, permeabilisiert und auf TgGAP45-Protein gefärbt, um die eingedrungenen (intrazellulären) Tachyzoiten sichtbar zu machen. Die Kulturen wurden mit PBS gewaschen, mit sekundären Antikörpern (Alexa488, Alexa594) markiert und zur Fluoreszenzbildgebung in DAPI-Fluoromount G montiert (Carl-Zeiss, Deutschland). Der Prozentsatz der eingedrungenen Parasiten (Invasionseffizienz) wurde anhand zweifarbiger Parasiten gezählt. Für Tests zum natürlichen Austritt wurden auf Deckgläsern kultivierte HFFs mit Parasiten infiziert (MoI: 2, 40 h/64 h, −/+ 100 µM IAA), gefolgt von einer zweistufigen Färbung (wie beim Invasionsassay), um gestörte und intakte zu unterscheiden Vakuolen32.

Bei einem einzelnen natürlichen Austrittsexperiment mussten wir die Parasitenvakuole zu zwei Zeitpunkten überprüfen, einen vor dem Austritt, um die Gesamt-PVs zu bestimmen (40 Stunden), und einen nach dem Austritt, um die verbleibenden PVs zu bewerten (64 Stunden). Nach 40 Stunden waren die Tachyzoiten im Begriff, sich auszubreiten, waren aber noch nicht ausgeschieden, wohingegen nach 64 Stunden alle Parasiten der Elternstämme ausgeschieden waren. Die Austrittsrate (%) wurde als [Anzahl intakter PVs (40 h) – Anzahl intakter PVs (64 h)]/Anzahl aller PVs (40 h) × 100 berechnet. Für den induzierten Austritt wurden die parasitierten Kulturen (MoI: 1, 24 h) wurden mit 500 µM Zaprinast behandelt (30 min). Hier wurde ein früherer Zeitpunkt (24-Stunden-Infektion, 8–16 Parasiten/Vakuole) gewählt, um sicherzustellen, dass unter nichtinduzierten Bedingungen kein Austritt erfolgte. Um die Parasitenausbeute zu quantifizieren, wurden Wirtszellen (106) in Kulturschalen (3 cm) mit Tachyzoiten (106 Parasiten, MoI: 1) infiziert und die Nachkommen wurden nach der Spritzenfreisetzung (27 G) nach 48 Stunden gezählt.

Basierend auf dem Parasitenertragstest wählten wir eine 48-Stunden-Infektion für die Probenentnahme aus. Lipide wurden aus frischen Pellets gereinigter Tachyzoiten (1 × 107/Probe) extrahiert, wie bereits berichtet7. Isolierte Lipide wurden unter einem Stickstoffstrom getrocknet und in 100 μl Chloroform und Methanol (1:1) gelöst, wovon 10 μl auf eine Acquity BEH C18 UPLC-Säule (2,1 × 100 mm, 1,7 μm) injiziert wurden, die bei 60 °C gehalten wurde . Die Trennung der Lipidspezies wurde mit einem Gradienten aus Methanol und Acetonitril in Wasser erreicht, die beide 2,5 mM Ammoniumacetat enthielten. Die Gradientenelution mit einer Flussrate von 600 µL/min wurde wie folgt programmiert (Zeit in Minuten, % B): (0, 12,5), (7,5, 100), (14, 100), (14,1, 87,5) , (17, 87,5). Das Abwasser wurde einer erhitzten Elektrospray-Ionisation in einem Sciex X500R QToF-Instrument unterzogen. Datenabhängige MS2-Spektren wurden gesammelt (MS1-Bereich 400–1050 amu; Vorläufer >600 amu; MS2-Bereich 50–1050 amu) mit einer Akkumulationszeit von 150 ms, einer Kollisionsenergie von 35 V und einer CE-Spreizung von 15 V. Datenverarbeitung wurde mit dem Analytics-Modul von SciexOS und MSDial42 durchgeführt.

Der Assay wurde wie zuvor für [13C6]-myo-Inositol12 beschrieben durchgeführt. Um extrazelluläre Parasiten mit [13C2]-Ethanolamin (Sigma-Aldrich, Deutschland) zu markieren, wurde die TgECT-AID-3xHA-Mutante 48 Stunden lang ohne oder mit 100 μM IAA vorkultiviert, gefolgt von einer Spritzenfreisetzung, einem Waschen mit PBS und einer Filterung durch 5 μm Filter, um die Rückstände zu entfernen. Parasiten (1 × 107) wurden dann in 100 μl DMEM (–/+ IAA), das 0,5 mM [13C2]-Ethanolamin enthielt, suspendiert und vor der Lipidomanalyse 6 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Zur intrazellulären Markierung von Parasiten in HFFs, die [13C2]-PtdEtn enthalten, wurden Wirtszellen in T-175-Kolben bis zur Konfluenz in 25 μM [13C2]-Ethanolamin gezüchtet. Die Kulturen wurden mit PBS gewaschen, um das überschüssige Isotop aus den Medien zu entfernen, und in Gegenwart eines 50-fachen Überschusses (1,25 mM) Ethanolamin mit Parasiten infiziert, um den Einschluss intrazellulär angesammelter Isotope in endogen produziertes PtdEtn der proliferierenden Tachyzoiten auszuschließen. Die Nachkommenparasiten wurden auf die Ester- und Ether-gebundenen PtdEtn-Spezies analysiert.

Die HFF-Monoschichten in T75-Kolben wurden 48 Stunden lang mit Tachyzoiten (MoI = 2) infiziert. Parasitierte Zellen wurden abgetrennt, mit PBS gewaschen und über Nacht in 2,5 % (v/v) Glutaraldehyd/PBS (0,1 M, pH 7,2) bei 4 °C fixiert. Die Proben wurden mit PBS gewaschen (3x, 30 Minuten bei Raumtemperatur), 2 Stunden lang in 1 % (Gew./Vol.) Osmiumtetroxid nachfixiert, 30 Minuten lang mit PBS nachgewaschen und in einer abgestuften Reihe von Acetonkonzentrationen dehydriert. Dehydrierte Blöcke wurden nach und nach infiltriert und in Spurr-Harz (SPI Chem, USA) eingebettet und dann 48 Stunden lang bei 65 °C polymerisiert. Die Proben wurden mit einem Diamantmesser in ultradünne Schnitte (60–70 nm dick) geschnitten, mit 2 % Uranylacetat angefärbt und bei 80 kV unter Verwendung eines Transmissionselektronenmikroskops (H-7650, Hitachi, Japan) abgebildet.

Sofern nicht anders angegeben, werden die in den Diagrammen dargestellten Daten als Mittelwert mit SE aus drei Experimenten mit repräsentativen Parasitenklonen dargestellt. Statistische Analysen wurden mit dem Programm GraphPad Prism (CA, USA) durchgeführt. Die Signifikanz wurde durch einen ungepaarten zweiseitigen t-Test mit gleicher Varianz getestet (*p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001). Wir haben die Falscherkennungsrate für den Mehrfachvergleichstest eingeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die im Rahmen dieser Studie generierten und/oder analysierten Daten werden im Hauptpapier (Abb. 1–8) und in den Zusatzdateien (Ergänzungsabbildungen 1–6, Tabelle 1) bereitgestellt. Die Originalbilder von Gel, Blot und Plaque sind in der ergänzenden Abbildung 6 dargestellt. Die Quelldaten für die Grafiken und Bilder finden Sie in den ergänzenden Excel-Dateien (Ergänzende Daten 1–2). Alle Ressourcen sind auf begründete Anfrage auch bei den Autoren erhältlich.

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Wir danken Grit Meusel (Humboldt-Universität, Berlin) für technische Unterstützung und Limin He (Huazhong Agricultural University, Wuhan) für die Unterstützung der Elektronenmikroskopie-Arbeit. Wir danken auch der Toxoplasma-Community für die Weitergabe der angegebenen Ressourcen. Diese Arbeit wurde hauptsächlich von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des Heisenberg-Programms (GU1100/16) und der Projektförderung (GU1100/17) an Nishith Gupta gefördert. Zusätzliche Mittel wurden Bang Shen von der National Natural Science Foundation of China (NSFC, 31961133032, Co-PI: Nishith Gupta) und Nishith Gupta vom DBT-Wellcome Trust (India Alliance, IA/S/19/1/504263) bereitgestellt. . Wir bedanken uns auch für die DFG-Förderung zur Anbahnung internationaler Zusammenarbeit (GU1100/15) und unterstützen einen kurzfristigen Besuch von Bang Shen in den Gupta Labs. Die gemeinsame Forschung von Xiaohan Liang an der Humboldt-Universität zu Berlin wurde durch ein Wissenschaftlermobilitätsprogramm (M0074) gefördert, das Nishith Gupta und Bang Shen vom Chinesisch-Deutschen Zentrum für Forschungsförderung (CDZ) gestiftet wurde. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf die Gestaltung, Datenerfassung, Analyse, Vorbereitung oder Entscheidung zur Veröffentlichung dieser Arbeit. Die Daten für diese Publikation wurden überwiegend an der Humboldt-Universität zu Berlin (HUB) generiert. Wir danken dem HUB Open Access Publication Fund für die Unterstützung der Kosten dieses Artikels.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Bingjian Ren, Xiaohan Liang.

Abteilung für Molekulare Parasitologie, Fakultät für Lebenswissenschaften, Humboldt-Universität, Berlin, Deutschland

Bingjian Ren & Nishith Gupta

Staatliches Schlüssellabor für landwirtschaftliche Mikrobiologie, Huazhong Agricultural University, Wuhan, China

Xiaohan Liang, Bang Shen und Nishith Gupta

Forschungsgruppe für Analysetechniken in den Biowissenschaften, School of Life Sciences and Technology, Avans University of Applied Sciences, Breda, Niederlande

Jos F. Brouwers

Intrazelluläre Parasiten-Bildungs- und Forschungslabore (iPEARL), Abteilung für Biowissenschaften, Birla Institute of Technology and Science, Pilani (BITS-P), Hyderabad, Indien

Wir retten Cross Miron und Nishith Gupta

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NG konzipierte und betreute das Projekt; BR, XL und RCM führten Experimente durch; BR, XL und NG analysierten die Daten und verfassten das Papier. JB führte die Lipidomanalyse durch; NG und BS akquirierten und verwalteten die Finanzierung. Alle Autoren haben das Papier überprüft, bearbeitet und genehmigt.

Korrespondenz mit Bang Shen oder Nishith Gupta.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen. NG ist Mitglied des Redaktionsausschusses der Zeitschrift Communications Biology, war jedoch weder an der redaktionellen Überprüfung noch an der Entscheidung zur Veröffentlichung dieses Artikels beteiligt.

Communications Biology dankt Hayley (E) Bullen und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: George Inglis.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Ren, B., Liang, X., Brouwers, JF et al. Synthese vs. Rettung von Ester- und Ether-verknüpftem Phosphatidylethanolamin im intrazellulären Protozoen-Erreger Toxoplasma gondii. Commun Biol 6, 306 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04664-x

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Eingegangen: 25. September 2022

Angenommen: 06. März 2023

Veröffentlicht: 22. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04664-x

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